凋亡相关基因caspase-3在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

孙 曼 蒋军广 张晓燕 史 江 安金路 楚玉洁 崔永亮 张艳梅

(郑州大学第一附属医院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052)

肺癌发病率、死亡率逐年增高。细胞凋亡异常在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。凋亡抑制基因、凋亡促进基因及凋亡效应基因的上调及下调，都可能打破细胞生成与死亡的平衡。肿瘤即为此平衡打破后所造成的细胞异常增殖与死亡。近年来对凋亡相关基因的研究越来越多〔1～3〕，但对半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)在细胞凋亡中的作用研究尚少。本文主要研究caspase-3在非小细胞肺癌(NSCLC)中表达及与细胞凋亡的关系进行分析。

1 对象与方法

1.1对家 随机选取我院2009～2011年经外科切除的NSCLC标本60例。年龄36～87〔平均(58.9±17.2)〕岁。所有病人在术前均未接受化、放疗，病理诊断明确。TNM分期按照美国联合癌症分类委员会和国际抗癌联盟制定的分期标准，其中男40例，女20例，鳞癌30例，腺癌30例。高分化15例，中低分化45例。TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期共39例，Ⅲ期和四期共21例。有淋巴结转移27例，无淋巴结转移33例。有胸腔积液11例，无胸腔积液49例。另设20例对照组，为癌旁5 cm以外的正常组织(经病理证实)，所有标本均为蜡块包埋，由专业人员切片，3片/例。

1.2方法

1.2.1主要试剂 Rabbit Anti-Caspase-3 来自北京博奥森生物技术公司；凋亡试剂盒购于美国罗氏公司；SP9000试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)试剂盒，购自北京中杉生物工程公司。

1.2.2免疫组化染色 所选的60例肺癌组织及20例正常肺组织常规切片，随即放入60℃烤箱内烘烤3 h， 切片脱蜡至水，将切片放入装有抗原修复液的缸子中，放入微波炉高温5 min，低温10 min后取出进行抗原修复，过氧化物酶(POD)阻断剂阻断内源性POD活性；非免疫性动物血清阻断非特异性反应；滴加一抗；加生物素标记的二抗；滴加辣根酶标记卵霉链白素； DAB显色；苏木素复染；梯度酒精脱水；中性树胶封片。

1.2.3细胞凋亡的检测 将切片脱蜡至水，滴加蛋白酶K，滴加DNA末端转移酶介导缺口末端标记法(TUNEL)反应混合液，滴加POD转换剂，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，中性树胶封片。

1.2.4caspase-3阳性结果判定 caspase-3染色为细胞质或(和)细胞核出现棕黄色颗粒。首先判定颜色，观察所有片子的染色，无染色(与背景染色无明显差别)计为0分，浅染色(细胞质、细胞膜染为浅棕黄色，与背景颜色有差别)为1分，染为棕黄色(1～3分)为2分，染为深棕黄色(与背景颜色差别显著)为3分。第二看染色细胞比例，高倍镜(400倍)下每个视野计数100个细胞，每张切片数5个视野，阳性细胞数占总癌症细胞百分比。0%为0分，0%～10%为1分，10%～50%为2分，>50%为3分。将以上所得分值相加为总分值，总分值<4为阴性表达，≥4为阳性表达。

1.2.5凋亡细胞的阳性结果判定 凋亡细胞经TUNEL法处理后，细胞核被染为棕黄色，使用光学显微镜，计数每1 000个肿瘤细胞中凋亡细胞的个数，进行分析。排除有严重的炎症反应和坏死灶的区域，以免造成假阳性。

1.3统计学方法 应用SPSS17.0软件进行分析，采用χ2检验或连续性校正的χ2检验，caspase-3与凋亡的关系采用直线相关性分析。

2 结 果

2.1caspase-3表达与临床病理的关系 经免疫组化染色后，细胞核和(或)细胞质被染成棕黄色，肺癌组织60例，阳性率为40%，正常肺组织20例，阳性率为40%，差异无统计学意义(χ2=0.000，P=1.000)。表1可见，有淋巴结转移者阳性率(7.4%)较无淋巴结转移者(66.7%)低(χ2=21.728，P=0.000)。TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期阳性率(56.4%)高于Ⅲ 期和Ⅳ期阳性率(9.5%)(χ2=12.50，P=0.000)。caspase-3表达与年龄、性别、病理分型、分化程度、胸腔积液、肿瘤直径、吸烟、肿瘤生长部位无明显关系(P>0.05)。

表1 NSCLC中caspase-3的表达及与临床病理特征的关系

2.2caspase-3与细胞凋亡之间的关系 caspase-3积分与凋亡指数(AI)呈正相关(r=0.834,P=0.000)。其中0分AI值3.67±0.59,1～2分为5.31±1.67，3～4分为7.47±1.34,5～6分为10.65±1.47。

3 讨 论

caspase-3为caspase家族中的重要组成成员，caspase在细胞凋亡中处于核心位置，其被上游信号激活后发生级联反应，导致细胞凋亡。caspase-3途径为大多数凋亡途径必不可少的，它的表达下调或缺失能影响多个因子对细胞凋亡的调控。

研究发现，caspase-3的表达异常与肝癌、宫颈癌、食管癌、胃癌等〔4～7〕多种肿瘤的发生均密切相关。夏钰弘等〔8〕通过对肝癌的研究发现caspase-3与肿瘤的分期有明显相关性，其表达越低，肝癌的恶性程度越高。夏丽〔5〕的研究证实caspase-3高分化、无淋巴结转移组中的表达要高于低分化和有淋巴结转移组，差异有统计学意义,从而推测caspase-3的低表达很可能促进了宫颈癌的发生发展。Sun等〔9〕研究提示caspase-3表达的下调或缺失与胃癌的发生有着密不可分的关系。有文献报道〔7〕caspase-3介导的细胞凋亡在食管癌发生的早期受到抑制,后期存在其他途径反馈激活。

本实验结果与郑春晨等〔10〕报道不一致，与洪江〔7〕研究的结论相似。考虑为肺癌组织在发生发展中不但存在过度增殖，也存在大量凋亡。而增殖的速度远大于凋亡。caspase-3在NSCLC中的表达与是否有淋巴结转移及肿瘤分期有关。提示caspase-3的表达下调与缺失在肿瘤的早期转移有一定关系。另外，本研究提示caspase-3的表达下调有益于临床分期，患者预后不好。这在李承慧等〔11〕的研究中也得到了证实。caspase-3与凋亡呈正相关，提示基因下调或缺失导致凋亡减少，与肿瘤的发生、发展密切相关，提示在NSCLC患者中修复此基因会对治疗有帮助，为NSCLC治疗提供了新的靶点。

4 参考文献

1蒋军广,王丽华，谭伟丽，等.N-cadherin在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义 〔J〕.中国肿瘤临床，2008；35(2)：96-8.

2杨 超，蒋军广，翟建霞，等.FADD在非小细胞肺癌组织中的表达及与癌细胞凋亡的关系〔J〕 .中国老年学杂志，2013；33(8)：1772-3.

3张婧雯，蒋军广，翟展艺，等.凋亡相关基因PDCD-5在非小细胞肺癌中的表达及临床意义〔J〕 .中国老年学杂志，2013；33(9)：2006-8.

4王维利，孟 刚. caspase-3 与Survivin 在肝细胞肝癌中的表达〔J〕.安徽医科大学学报，2006;41(3):278-80.

5夏 丽.NF-κB，c-IAP2，caspase-3在宫颈癌中的表达及意义〔D〕.河南科技大学硕士论文，2010.

6饶 韬.caspase-3、caspase-6在胃癌组织中的表达及意义〔D〕.南昌大学硕士论文，2011.

7洪 江.S100A8和caspase-3在食管癌中表达的相关性及其临床意义〔D〕.复旦大学硕士论文，2009.

8夏钰弘,周 婧,常艳华,等.肝细胞肝癌组织中NK-κB和Caspase-3的表达及意义 〔J〕.中国现代医学杂志，2012；22(3)：26-9.

9Sun Y,Chen XY,Liu J.Differential caspase-3 expression in noncancerous，premalignant and cancer tissues of stomach and its clinical implication〔J〕.Can Detect Prev,2006；30(2)：168-70.

10郑春晨，陈愉生，陈小岩，等.Livin、caspase-3和Bel-2在非小细胞肺癌的表达及生存分析〔J〕.中国呼吸与危重监护杂志，2009；8(3):224-8.

11李承慧，胡 冰，王晓秋，等.非小细胞肺癌中caspase-3、survivin和k-ras的表达及其意义〔J〕.中国肺癌杂志，2008;11(1):90-6.