怀化侗族高血压人群IL-1Ra、CK-18、α-烯醇化酶蛋白质表达差异

金 玲 幸 梓 刘卫武 何小进 段于峰 曹湘玉

(怀化医学高等专科学校，湖南 怀化 418000)

中国高血压患者脑卒中的发生率要远远高于欧美国家，本研究采用蛋白质组学的技术，分析怀化侗族高血压、汉族高血压及侗族正常人血淋巴细胞表达的差异，以进一步揭示高血压的免疫和炎症特性。

1 材料与方法

1.1研究对象 2011年9～10月在怀化医学高等专科学校附属怀化市第三人民医院心血管内科高血压住院患者40例(继发高血压除外)，汉族，组成汉族高血压组。其中男20例，女20例，年龄45～81〔平均(57.49±7.71)〕岁；怀化通道侗族自治县陇城乡自然村落中随机选取侗族高血压患者50例作为侗族高血压高发组，年龄40～73〔平均(54.64±6.23)〕岁；再在该村落随机选取40例正常人作为侗族正常组，年龄40～71〔平均(51.41±5.62)〕岁。

1.2高血压诊断标准 采用《1999年WHO/ISH高血压指南》制订的高血压诊断标准，在未使用抗高血压药物的情况下，收缩压(SBP)≥ 140 mmHg和(或)舒张压(DSP) ≥ 90 mmHg即确定为高血压；既往有高血压史，目前正在使用抗高血压药物，现血压虽未达到上述水平，亦诊断为高血压。

1.3主要试剂和仪器 主要试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、SDS、Tris、甘氨酸、Triton X-100、碳酸氢胺、乙腈、甲酸购自USB公司；二硫苏糖醇、碘乙酰胺、固相pH梯度干胶条、IPG缓冲液、两性电解质、胰蛋白酶、考马斯亮蓝G-250均购自Amersham bioscience公司。主要仪器：IPGphor等电聚焦仪(Amersham Bioseiences公司)；Ettan DALT垂直电泳槽(Amersham Biosciences公司)；SDS.PAGE电泳仪(Bio-Rad公司)；Imagescanner扫描仪(Amersham Bioscienees公司)；低温高速离心机(Beckman公司)；Voyager MALDI-TOF质谱仪(ABI公司)。

1.4方法

1.4.1样品制备和蛋白浓度测定 将采集的新鲜血(肝素抗凝20 U/ml)2 ml加Hank液2 ml，混匀。小心将稀释后的血液缓慢的沿管壁加入预先加有2 ml淋巴细胞分离液的10 ml玻璃试管中，使加入的血液留在分离液的上面。以1 500 r/min离心(半径15 cm水平转子)15 min，小心取出，吸取淋巴细胞层(顺次为血浆-淋巴细胞层-分离液-红细胞)，于另一试管中，加入4倍左右的Hank液，混匀，以2 000 r/min离心10 min。吸掉上层液体，将沉淀用Hank液反复洗两次，最后用PBS液洗一次，2 000 r/min离心10 min将细胞离心到管底，将所得细胞按1∶4比例加细胞裂解液裂解，4℃放置1 h，24 000 r/min,离心60 min，取上清得所需蛋白质，再用蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白质浓度。

1.4.2二维凝胶电泳

1.4.2.1第一向固相pH梯度等电聚焦(IEF) 操作步骤主要依据IPGphor等电聚焦系统使用指南进行〔1〕。首先将血淋巴细胞总蛋白质与水化液充分混合，使上样总体积控制在350 μl(含总蛋白质1 000 μg)。然后将混合液均匀地加入IPG胶条槽，再取出IPG干胶条，揭去保护膜，把胶面朝下置入胶条槽并与胶条槽的电极紧密接触，以避免出现气泡。覆盖一层Immobiline Drystrip覆盖液后盖上胶条槽的盖子，放置于IPGphor等电聚焦仪上，确定胶条槽的电极与聚焦仪面板接触正确后，关上安全盖。设置程序，使水化和聚焦均在20℃下进行，总电压时间设为80 000 Vh，其中于30 V低电压水化14 h，然后经过500 V 1 h、1 000 V 1 h，5 000 V 1 h，最后稳定在8 000 V下进行等电聚焦8.5 h。

1.4.2.2平衡 等电聚焦后立即取出IPG胶条，先后置于10 ml平衡A液和10 ml平衡B液中，在摇床上摇振，再各平衡15 min。

1.4.2.3第二向垂直SDS-PAGE电泳 将平衡后的胶条移至浓度为12.5%、厚0.75 mm的PAGE分离胶上端，排净气泡后，以0.5%的琼脂糖封胶。电泳条件为：2.5 W/胶电泳30 min，然后以11 W/胶恒功率电泳，直至溴酚蓝指示线达到凝胶底边处，停止电泳。

1.4.3考马斯亮蓝G-250染色 从玻璃板上将凝胶剥离下来后放置于干净的染色盘中，在每块凝胶中加入250 ml考马斯亮蓝G-250进行染色，摇床上缓慢摇动。染色后倾倒染色液用含20%乙醇的脱色液进行脱色，直至背景清晰。

1.4.4凝胶图像分析 凝胶经Imagescanner扫描仪扫描，获取分辨率为300DPI图像(图像和凝胶大小比例为1∶1)，再用Image Master图像分析软件先后进行点检测、背景消减、标准化、匹配、建立平均凝胶、差异比较等分析。

1.4.5质谱分析

1.4.5.1质谱样品制备 将移液器的吸头尖端用剪刀剪掉，使其孔直径与欲取蛋白质点的大小一致，用修剪后的吸头从凝胶上切取差异蛋白质点，放置于1.5 ml Eppendorf管中；用双蒸水振动洗涤3次；每点加脱色工作液(200 mmol/L NH4HCO3∶100% ACN=1∶1)50 μl，在37℃恒温水浴箱中水浴30 min，等凝胶蓝色消退后，弃去脱色工作液，再用超纯水反复冲洗至无色；每点加入100% ACN 100 μl，脱水2次； 把胶块用冷冻干燥仪抽干10 min至完全脱水；每点加酶解工作液(40 mmol/L NH4HCO3溶解的O.04 μg/μl TPCK-Trypsin酶液)5 μl同时在冰上吸胀60 min；每点加酶解缓冲液30 μl(200 mmol/L NH4HCO3200 μl+100%ACN 90 μl+双蒸水710 μl)，在37℃恒温水浴箱中酶解24 h或过夜；将上清液收集于0.5 ml Eppendorf管中；每胶点加萃取工作液(100%ACN∶5%甲酸=1∶1)30 μl，37℃恒温水浴箱中水浴60 min；在冷冻干燥仪中完全浓缩至冻干，备用。

1.4.5.2MALDI-TOF-MS质谱分析 将点样板制备好，用Voyager-DE STR 4307 MALDI-TOF-MS质谱仪进行分析，进行反射模式，正离子谱测定，采用20 000 V的离子源加速电压，反射电压比使用1.12，N2激光波长为337 nm，脉冲宽度3 ns，离子延迟抽提100 ns，真空度4×10-7Torr，质谱信号单次扫描累加50次，外部标准采用ACTH，内部标准校正使用胰蛋白质酶自切降解峰(842.510，2 211.105)，获得肽质量指纹图(PMF)。

1.4.5.3数据库查询 采用MatrixScience公司的Mascot Distiller或Mascot Wizard软件进行MALDI-TOF-MS质谱图解谱，在计算机上仍需安装ABI公司的Data ExploreTM软件以便Mascot Distiller或Mascot Wizard调用Data ExploreTM软件来处理ABI公司MALDI-TOF-MS质谱产生的原始文件进行解谱。Mascot Distiller或Mascot Wizard软件均使用其默认参数设置。采用MatrixScience公司的Mascot进行数据库查询，查询网址为http：//www.matrixscience.com/cgi/search-form.pl? FORMVER=2&SEARCH=PMF。数据库检索参数为：Your name和E-Mail内输入相应的名字和E-Mail地址，数据库选用NCBInr数据库，物种分类(Taxonomy)选用人类(Homo sapiens)，酶选用Trypsin，选择1为允许的未酶切位点，固定修饰(Fixed modifications)选用碘乙酰胺Carbamidomethyl(C)修饰，可变修饰不选，选用100 ppm为肽片段容差，Mass values选择MH+，选择Monoisotopic，选用直接输入Mascot Distiller或Mascot Wizard产生的临时文件或单同位素峰的列表(Peak Lists)即能进行数据库检索。

1.5统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.12-DE图谱的重复性和分辨率 为了保证结果的可靠性，在相同条件下分别对侗族高血压、侗族正常人、汉族高血压三组血淋巴细胞总蛋白质样品各进行了三次重复双向凝胶电泳分离，凝胶显色后得到背景清晰、匹配性好、分辨率高的2-DE图谱(上样量为1 000 μg)，蛋白质点的重复性好，证明样品制备稳定,能够用于差异蛋白表达研究的分析。

2.2淋巴细胞蛋白表达的比较 以侗族正常人血淋巴细胞蛋白二维电泳图谱为基准，侗族高血压图谱点440表达上调，点391表达差异无统计学意义(P﹥0.05)，点527表达下调；汉族高血压图谱391、440两个点表达上调，点527表达下调。见表1，图1。

2.3质谱鉴定结果 用MALDI-TOF-MS质谱分析对3组的上述3个差异蛋白点进行质谱分析，质谱图见图2，质谱鉴定结果，见表2。

图1 淋巴细胞蛋白二维电泳图谱

表1 三组蛋白点差异比较

表2 差异蛋白质鉴定结果

A：391号蛋白质点的PMF图；B：440号蛋白质点的PMF图；C：527号蛋白质点的PMF图

3 讨 论

最近的研究结果表明：免疫系统中的淋巴细胞特别是T淋巴细胞激活参与了高血压的病理生理及炎症过程〔2〕；Guzik等〔3〕也通过重组激活基因敲除小鼠模型研究发现，T细胞参与血压升高及血管损伤。因此探讨免疫细胞参与血压升高的机制具有重要的现实和临床意义。本研究采用二维凝胶电泳联合质谱技术(2-DE/MS)，初步获得重复性好的血淋巴细胞蛋白质双向凝胶电泳图谱，运用MALDI-TOF-MS成功鉴定了20个蛋白点的信息，并对其中IL-1、细胞角蛋白18、α-烯醇化酶3个差异表达蛋白点进行分析。

IL-1家族包括IL-1α、IL-1β和IL-1Ra，是炎症反应的重要标志物，由多种细胞如单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、内皮细胞和间质细胞等产生，起介导炎症反应的作用。国内外学者研究发现：IL-1活性在很大程度上取决于IL-1Ra对其的调控〔4〕；IL-1Ra在感染、脓毒血症、创伤、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎等急慢性炎症及免疫疾病中升高〔5，6〕；IL-1Ra也可能在糖尿病微血管病变中发挥重要的效应〔7〕。本实验中，侗族高血压和汉族高血压人群IL-1Ra的表达与侗族正常人比较均出现下调，这一结果提示，IL-1Ra的表达可能与高血压存在相关性，与Lin等〔8〕研究英国凯尔特白人群体高血压，发现IL-1Ra多态性与高血压病存在相关性的结果一致；但与李艳等〔9〕研究我国湖北省汉族人群高血压发现IL-1Ra多态性与高血压病之间不存在相关性这一报道不一致，这可能与不同地域、不同种族高血压人群的发病特点有关，针对该结果，我们将把IL-1Ra作为高血压诊断的可能候选生物标记物进行进一步的重点研究。

CK-18，KRT18属于细胞骨架中间丝蛋白中的角蛋白家族成员，是肝细胞相对特异性标志,主要分布于所有的正常上皮细胞及上皮性癌细胞中。以往的研究发现：该蛋白在肿瘤细胞中表达丰富；而有限的临床流行病学研究资料也提示该蛋白与乳腺癌的预后密切相关〔10〕。本实验中汉族高血压人群CK-18的表达与侗族正常人比较出现上调，而侗族高血压人群CK-18的表达与侗族正常人比较差异无统计学意义，具体机制不明，有待于进一步研究。

神经元特异性烯醇化酶(NSE)是一个较为敏感的特异性反映神经元损伤的量化指标〔11〕，NSE的定量测定可作为判断高血压脑出血急性期病情轻重及评价发生意外的客观指标〔12〕,大量的研究已证实：NSE与高血压病情发展、恶化密切相关〔11～14〕，但α-烯醇化酶与高血压的关系，目前尚未发现相关报道。在本实验中，通过蛋白质组学研究发现无论是侗族高血压还是汉族高血压均可见α-烯醇化酶表达上调，这提示α-烯醇化酶可能是一种潜在的高血压诱导剂，可作为预测高血压发生、发展程度的一个候选生物学标志物。

4 参考文献

1Gorg A，Obermaier C，Boguth G，etal.The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients〔J〕.Electrophoresis，2000；21(6)：1037-53.

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3Guzik TJ，Hoch NE，Brown KA，etal.Role of the T cell in the genesis 0f angiotensin Ⅱ induced hypertension and vascular dysfunction〔J〕.J Exp Med，2007；204(10)：2449-60.

4Slotwinski R,Olszewski WL,Slotkowski M,etal.Can the interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) be a marker of anti-inflammatory response to enteral immunonutrition in malnourished patients after pancreatieoduodenectomy〔J〕.JOP，2007；8(6)：759-69.

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7Abrahamian H，Endler G，Exner M，etal.Association of low-grade inflammation with nephropathy in type 2 diabetic patients：role 0f elevated CRP-levels and 2 different gene-polymorphisms of proinflammatory cytokines〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2007；115(1)：38-41.

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9李 艳，徐 朴，张平安，等.白细胞介素-1基因多态性与高血压易感性的研究〔J〕.中华医学遗传学杂志，2004；21(5):491-3.

10Becker M，Nitsche A，Neumann C，etal.Sensitive PCR method for the detection and real-time quantification of human cells in xenotransplantation systems〔J〕.Br J Cancer,2002；87：1328-35.

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