SiHa细胞中miR-886-5p表达抑制稳定细胞系的建立

王建新 马翠花

(秦皇岛市第一医院检验科， 河北 秦皇岛 066000)

宫颈癌已成为女性生命和健康的严重威胁〔1～3〕。尽管高致病性人乳头瘤病毒(HPV)的感染被认为是宫颈癌的主要发病原因，但越来越多的证据表明HPV感染并非宫颈癌发病的单一因素〔4〕。microRNAs(miRNAs)是一类长约21～24个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，抑制很多靶基因的表达〔5〕。miRNAs在调节细胞增殖、凋亡以及肿瘤的发生过程中起重要作用〔6，7〕。很多miRNAs在不同的癌组织中都有异常表达，可能与肿瘤的发生相关〔8～10〕。研究发现在宫颈癌中miRNAs的异常表达与宫颈癌的发生发展密切相关〔11～13〕。基因芯片研究发现miR-886-5p在宫颈癌中的表达明显高于癌周及正常组织〔14〕。本实验通过稳定转染宫颈癌SiHa细胞带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的miR-886-5p inhibitor/NC，抗生素筛选后选择表达GFP的阳性克隆进行培养，得到稳定表达抑制miR-886-5p的SiHa细胞系，为深入研究miR-886-5p在宫颈癌SiHa细胞中的作用提供了良好的实验模型。

1 材料和方法

1.1实验材料 宫颈癌SiHa细胞购自协和医科大学基础医学研究所。带有GFP标签的抑制miR-886-5p表达质粒及对照质粒(miR-886-5p inhibitors/NC)均来自中国吉玛公司。主要试剂：DMEM 培养基购自GIBCO 公司，三氯甲烷、异丙醇和无水乙醇均购自北京化学试剂公司，TRIzol 试剂，MML-V试剂盒和LipofectamineTM2000 均为美国 Invitrogen公司产品，质粒小量提取试剂盒购自博大泰克公司，SYBR Premix Ex Taq试剂购自TakaRa公司，PCR 扩增引物的合成与 DNA 测序均由上海生工公司完成。

1.2细胞培养与转染 SiHa细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基内，每3 d换液1次，0.25%胰酶消化传代，倒置显微镜下观察。在转染前1 d用12孔板接种细胞，5×105个/孔，培养过夜，待转染带有GFP标签的miR-886-5p inhibitor/NC质粒，每组3个复孔。细胞长满60%培养孔底时，用不含血清的DMEM各500 μl分别稀释2 μg待转染质粒和5 μl LiPofectamine2000转染试剂，室温放置5 min后，将两者混合作用20 min形成DNA-脂质体复合物。分别将1 ml带有miR-886-5p inhibitor/NC质粒的DNA-脂质体复合物加入各培养孔，轻轻摇匀，37℃、5% CO2、饱和湿度下培养过夜。

1.3转染细胞的筛选 细胞转染24 h后，加入5 μg/ml Blasticidin进行筛选，每5 d换液1次，直到长出细胞克隆，在显微镜下用胰酶消化，挑出克隆，移至10 cm细胞培养皿继续用Blasticidin筛选液培养。3～4 w后，荧光倒置显微镜下观察表达GFP的阳性克隆，再次用胰酶消化，挑出阳性克隆并用1 μg/ml Blasticidin筛选液大量培养。

1.4RNA提取及茎环结构的逆转录 分别收集培养的转染不同质粒SiHa细胞(约5×106个)，按产品说明书，加入1 ml TRIzol试剂，吹匀后室温放置5 min，加入氯仿 0.2 ml，剧烈摇晃15 s，室温放置3 min，异丙醇沉淀10 min，12 000 r/min 4℃离心10 min，弃上清，加入1 ml 75%乙醇振荡洗涤后7 500 r/min 4℃离心5 min，吸弃上清，室温干燥10 min，加入50 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，55℃放置10 min，紫外分光光度计定量。用1%琼脂糖凝胶电泳监测RNA质量。茎环逆转录miR-886-5p的引物为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACC-CGCTT-3′；以hs-U6作为内参，引物序列为5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.5实时定量PCR 取总RNA(1～2 μg)，用SYBR Premix Ex Taq Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，蒸馏水补足20 μl体积。以hs-U6作为内参，进行实时定量PCR反应检测miRNA的表达，反应包括40个循环(95℃，30 s；60℃，1 min)，每次设立3个复孔。特异性miR-886-5p的上下游引物分别为5′-CGGGTCGGAGTTAGCTCA-3′和5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 snRNA的上下游引物分别为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′和 5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。其扩增曲线和融解曲线说明引物具有很好的特异性，将扩增产物进行DNA测序分析进一步证实扩增特异性。采用ΔΔCt法分析基因的表达水平〔15〕，即RQ=2-ΔΔCt，〔ΔΔCt=(CtmiRNA-CtU6)样品(CtmiRNA-CtU6)校正样品〕。每次实验包括以水为模板的阴性对照，根据(2-ΔΔCT)计算每对样本的相对表达量。

(A)SiHa细胞系稳转GFP标记的miR-886-5p表达抑制及对照质粒筛选4 w后荧光镜图片；(B) SiHa细胞系稳转miR-886-5p表达抑制及对照质粒后miR-886-5p表达量的qRT-PCR验证，U6snRNA为内参，1)P <0.05

2 结 果

用带有GFP标签的miR-886-5p inhibitor及对照质粒转染SiHa细胞，Blasticidin筛选3～4 w后于荧光倒置显微镜下观察表达GFP的阳性克隆(图1)。挑取阳性克隆大量培养后用qRT-PCR验证稳转细胞中miR-886-5p的表达差异，每组3个复孔，实验重复3次，差异显著(P<0.05)。见图1。

3 讨 论

众所周知，高危型HPV感染是宫颈癌发病的主要原因，其分子机制也成为人们研究的焦点。然而HPV感染并不能为宫颈癌的恶变过程提供足够的证据，目前其他因素对宫颈癌的影响也受到了关注〔14〕。

研究报道显示不同miRNAs的异常表达在不同的癌症中起着不同的作用〔16～18〕。miRNAs表达分析显示miR-143和miR-145在宫颈癌组织及宫颈癌相关细胞系中表达下调，它们起着抑制宫颈癌相关细胞的生长作用；而miR-146a在宫颈癌组织及宫颈癌相关细胞系中表达上调，能促进宫颈癌相关细胞的增殖〔12〕。

目前关于miRNAs与宫颈癌细胞的凋亡之间的关系研究很少，有研究发现miR-886-5p在宫颈癌的含量明显高于癌周及癌旁组织。

4 参考文献

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