不育患者精浆中性α-1，4-糖苷酶活性与精液参数及精子透明质酸酶活性的关系

马晓萍，高晓勤，杨燕平，杨 喆

(1.遵义医药高等专科学校，贵州 遵义 563002;2.贵阳医学院组织胚胎学教研室，贵州 贵阳 550004)

精浆中性 α-1，4-糖苷酶(alpha-1，4 glycosidase，α-1，4-G)来源于附睾，由附睾上皮分泌，是附睾功能的特异性酶及标志酶[1]。常规精液分析(routine semen analysis，RSA)一直是评价男性生育力的主要实验室手段，但仅依靠其结果来预测男性生育状况是不全面的。精浆中性α-1，4-G可间接反映附睾的功能及对精子各种参数的影响。精子透明质酸酶(hyaluronidase，HYD)是一种重要的存在于精子顶体的酶，是受精过程中的关键酶之一。我们分析了不育患者精浆中性α-1，4-G活性与RSA参数、HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)的关系，以探讨其间的相关性。

材料和方法

一、对象

正常生育组12名，均为有生育能力的男性自愿献精者，年龄24～40岁。不育组52例，选自贵阳医学院附属医院生殖检验中心就诊患者，年龄24～40岁，均为婚后正常性生活2年以上不育(排除女方不育原因)，无外伤及遗传性疾病家族史，无性功能障碍病史，体检未发现有明显睾丸、附睾及输精管异常。精浆中性α-1，4-G活性参考区间按文献[2]界定。根据精浆中性α-1，4-G活性检测结果将不育患者分为中性α-1，4-G活性正常组(简称酶活性正常组)与中性α-1，4-G活性异常组(简称酶活性异常组)。

二、主要仪器及试剂

Anke-GL-16 G-Ⅱ型高速冷冻离心机(上海安亭仪器厂)，SPX-150C型恒温恒湿箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，Sartorius BS2103型电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)，伟力WLJY9000彩色精子质量检测系统(北京伟力新世纪科技发展有限公司)，Mias摄影图象分析系统(上海天程科技有限公司)，精浆中性α-1，4-G定量检测试剂盒(酶法，深圳华康生物医学工程有限公司)。

三、方法

1.精液常规分析 禁欲3～7 d后手淫或取精器取精液于干燥消毒量杯内，置37℃水浴箱内液化。按照世界卫生组织(WHO)的精液分析标准[3]进行分析。

2.精浆中性α-1，4-G活性及HYD活性检测 精液以500×g离心10 min，分离上层精浆，置－20℃ 冻存备用。采用酶法检测精浆中性α-1，4-G活性，严格按试剂盒说明书操作。下层精子以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，采用改良固定底物膜法[4]进行精子HYD阳性率及HYD活性强度检测。

四、HYD活性检测

1.HYD阳性反应率 终止孵育后，每份孵育片于LeicaDME光学显微镜下均匀选取5～6个视野，随机观察200个精子头部，出现周围晕环者视为HYD阳性反应。

2.HYD活性强度 采用测微尺测量视野下每个精子头部晕环直径的大小，取其平均值作为判断HYD活性强度的指标。

五、统计学分析

结 果

一、不育组和正常生育组精浆中性α-1，4-G活性、RSA参数及HYD活性比较

不育各组中精子密度、精子活动率和HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)均明显低于正常生育组(P＜0.01)。酶活性异常组的畸形精子率明显高于正常生育组(P＜0.01)。活性正常组精浆中性α-1，4-G活性、精子密度、精子活动率及HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)均高于酶活性异常组。见表1、图1、图2。

表1 不育组和正常生育组精浆中性α-1，4-G活性、RSA参数、HYD活性比较()

表1 不育组和正常生育组精浆中性α-1，4-G活性、RSA参数、HYD活性比较()

注:与正常生育组比较，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;与酶活性正常组比较，#P ＜0.01

组别 例数 精浆中性α-1，4-G活性(m U)精子密度(×10 9/L)精子活动率(%)H Y D阳性反应率(%)H Y D活性强度(μ m)畸形精子率(%)正常生育组 12 60.67 ±10.12 96.33 ±15.03 73.11 ±7.43 77.96±9.29 48.94 ±10.56 41.42 ±6.75不育组 52酶活性正常组 39 42.17 ±12.08＊＊65.09 ±22.41＊＊ 55.38 ±16.72＊＊ 44.15 ±14.39＊＊ 32.30 ±16.06＊＊51.99 ±9.92*酶活性异常组 13 14.12 ±2.91＊＊#25.21 ±17.10＊＊#29.00 ±10.07＊＊#20.90 ±8.92＊＊#10.09 ±5.41＊＊#57.21 ±7.23＊＊

图1 正常生育组的HYD阳性反应率、HYD活性强度

图2 酶活性异常组的HYD阳性反应率、HYD活性强度

二、精浆中性 α-1，4-G活性与 RSA参数、HYD活性相关分析

精浆中性α-1，4-G活性与精子密度、精子活动率和HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)呈正相关(r值分别为 0.816、0.890、0.872和0.847，P 均 ＜0.01);与畸形精子率呈显著负相关(r= －0.579，P ＜0.01)。

表2 精浆中性α-1，4-G活性与精液参数、HYD活性的相关分析

讨 论

附睾对于精子成熟与储存具有重要作用。精浆中性α-1，4-G是由附睾上皮分泌。研究表明，中性α-1，4-G可通过催化精子糖原降解，为精子基本代谢、成熟、获能、运动和受精提供能源[1]。在某些异常情况下，如附睾炎、输精管道阻塞时中性α-1，4-G分泌减少，精浆中酶活力降低，影响精子的能源供应，影响生育[5];还有感染、不良生活习惯等[6-7]因素。精液中高浓度一氧化氮(NO)也可能是男性生育力下降的原因之一[8]。

Mahmoud等[9]报道不育症患者精浆中性α-1，4-G活性与精子数目、精子活动力呈正相关。本研究结果也显示中性α-1，4-G活性与精子密度、精子活率呈正相关。由此推测这种相关性可能是睾丸生精过程与该酶活性水平都受到雄性激素调节所致。本研究结果还显示，随着中性α-1，4-G活性降低，精子密度减少、精子活动率减弱，而畸形精子率随之增加。这与刘睿智[10]等报道的结果不相一致，推测原因正如一些研究[11-12]所报道:精浆中性α-1，4-G活性与精子正常形态率呈正相关，这可能与附睾功能正常者精子形态成熟度较高有关;反之，精浆中性α-1，4-G活性偏低多提示附睾功能存在异常，可导致未成熟精子比例增高，并通过活性氧损伤和凋亡等机制影响精子形态和存活。说明任何可能引起附睾功能受损或精浆中性α-1，4-G活性减低的因素都会导致精液质量下降。

研究表明，生殖道感染对附睾功能有干扰作用，导致中性α-1，4-G活性降低。同时引起附睾功能障碍因素(如附睾炎、解脲脲原体感染)亦可引起精子顶体膜破损，使顶体内酶流失，导致部分患者不育[13]。精子HYD是一种存在于精子顶体的重要酶。HYD活性检测是一种有效检查精子受孕能力的手段[14]。本研究运用改良固定底物膜法来检测精子顶体内HYD活性，能反映单个精子内HYD活性的强弱及阳性率高低，比以往的生化检测法更具临床优势及实用性。本研究结果表明精浆中性α-1，4-G活性与HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)呈正相关，且正常生育组HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)明显高于不育各组。说明精浆中性α-1，4-G活性可影响顶体内酶活性，精浆中性α-1，4-G活性低下可能是导致男性不育的主要原因之一。

综上所述，精浆中性α-1，4-G活性可以影响精子密度、活率、畸形精子率、HYD活性(HYD阳性反应率、HYD活性强度)，从而影响生育。因此，精浆中性α-1，4-G活性为临床诊断男性不育、评估精子生育能力提供了一个基础理论依据。

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