2010年广州市甲型H1N1流感病毒分离株NA基因变异分析

许沙沙，常彦敏，徐 霖，冯发深，何 霞，王 铸，张定梅，曹开源

(1.衡水市哈励逊国际和平医院检验科，河北 衡水 053000;2.郑州大学附属肿瘤医院检验科，河南 郑州 450000;3.中山大学临床检验标准化研究中心，广东 广州 510080)

流感病毒是有包膜的单股负链RNA病毒，属于正黏病毒科(orthomyxoviridae)，根据核衣壳蛋白和基质蛋白不同，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)3型[1]。甲型H1N1流感于2009年3月在墨西哥爆发，最初被称为“人感染猪流感”，世界卫生组织将流感大流行警告级别提高为6级[2]，2009年4月中国卫生部发布公告，明确将猪流感更名为“甲型H1N1流感”。据世界卫生组织统计，截至2010年3月19日，这种新病毒已经波及213个国家，共造成16813例死亡[3]。许多学者认为华南地区是世界流感流行的一个主要起源地，因此加强对甲型H1N1流感的监测对我国传染病防控具有重要意义[4]。神经氨酸酶(neuraminidase，NA)是流感病毒表面重要的糖蛋白，是甲型流感病毒主要抗原之一，对于流感病毒从感染细胞中的释放非常重要。为了监测甲型H1N1流感NA基因的变异情况，及时发现具有流行病学意义的耐药株，我们对2010年从广州采集的1194份呼吸道标本中分离到的6株甲型H1N1病毒株NA基因进行测序，与2009年的代表株进行比对，对其耐药位点和同源性进行分析，了解其变异情况，为今后流感的监控和防治提供参考资料。

材料和方法

一、标本来源

2010年2到12月广州市中山大学附属二院和三院发热门诊病例咽拭子标本1194份，病例纳入标准为:发热3 d以内，体温≥38℃;伴有咳嗽或咽喉疼痛等急性上呼吸道感染症状。

二、毒株

2010年本实验室分离的甲型H1N1流感病毒和2009年3月本实验室从广州市第1例甲型H1N1流感病毒感染患者体内分离的毒株，名称为A/Guangdong/03/2009(H1N1)(GenBank登录号GQ250161);从GenBank中选取北京、上海、广东三地在2009年甲型H1N1流感流行时的NA序列共9株，用以基因分型和比较，见表1。

表1 NA基因用以进化分析的毒株

三、RNA的提取和cDNA的合成

对采集的咽拭子标本进行处理，各取200 μL提取RNA(QIAmp MiniElute Virus Spin试剂盒)，逆转录合成 cDNA(Invitrogen，SuperscriptⅢ first strand逆转录试剂盒)，操作步骤参照说明书进行，反应条件为:25℃ 10 min，50℃ 50 min，85℃5 min，37 ℃ 20 min。

四、甲型流感检测

对1194份标本的cDNA全部进行甲型流感病毒检测。

1.引物 参照国家流感中心下发的引物，目标片段为M基因，上游引物5'-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3'，下游引物 5'-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3'，特异产物长度235 bp。

2.聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)反应体系 TaKaRa ExTaq mix 12.5 μL，焦碳酸二乙酯水 7.5 μL，上、下游引物各 2 μL;cDNA模板 1 μL。反应条件:95 ℃ 5 min，94 ℃30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环，72 ℃10 min。

五、甲型H1N1流感病毒检测

对甲型流感病毒检测阳性的标本进行甲型H1N1流感病毒特异PCR检测。

1.引物 参照国家流感中心下发的引物，目标片段为HA基因，上游引物5'-AATAACATTAGAAGCAACTGG-3'，下游引物5'-AGGCTGGTGTTTATRGCACC-3'，特异产物长度153 bp。

2.PCR 同上。

六、NA克隆和序列测定

参考GenBank中甲型H1N1流感病毒株NA序列(GenBank登陆号GQ250162)分别设计分段引物 NA-1和 NA-2，NA-1引物扩增1～643 bp，NA-2引物扩增 505～1410 bp，NA基因全长1410 bp，引物序列见表2。

表2 NA基因扩增引物

PCR 反应体系:TaKaRa ExTaq mix 25 μL，焦碳酸二乙酯水 15 μL，上下游引物各 4 μL，cDNA模板2 μL。反应条件:95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环，72 ℃ 10 min。

胶回收试剂盒(TAKATA)回收PCR产物，连接到pMD 18-T Vector(TAKATA)，转化 DH-5α感受态细胞，用Amp+LB筛选阳性菌落提取重组质粒，PCR初步鉴定重组质粒，送上海英骏公司测序。

七、变异分析

利用 Clustal 1.83软件[5]对测序毒株 HA基因序列和氨基酸序列进行比对和分析，利用Glyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-NGlyc/)在线软件预测其糖基化位点，并对其耐药位点进行分析。

八、系统进化分析

将分离的6株广州甲型H1N1流感病毒分离株和从GenBank中筛选的9株甲型H1N1流感病毒的 HA基因用 MEGA4.0软件[6]近邻连接法(neighbor-joining method)构建系统进化树。

结 果

一、标本流行病学资料

1194份咽试子标本中检测甲型流感病毒327份，其中检测到H1N1流感病毒6株。

二、甲型流感病毒PCR检测结果

PCR扩增结果表明成功扩增大小约235 bp的甲型流感病毒特异性片段，见图1。

三、H1N1流感病毒PCR检测结果

PCR扩增结果表明成功扩增大小约153 bp的甲型H1N1流感病毒特异性片段，见图2。

四、甲型H1N1流感病毒的NA基因PCR扩增及测序

6株甲型H1N1流感病毒分离株NA-1段基因的逆转录PCR产物全长643 bp，见图3。6株甲型H1N1流感病毒的NA-2段基因的逆转录PCR产物全长905 bp，与理论值相符，见图4。回收PCR扩增产物，与T载体连接，由上海英骏公司进行测序(结果略)。

图1 甲型流感病毒电泳结果(部分结果)

图2 甲型H1N1流感病毒电泳结果

图3 NA-1片段逆转录PCR电泳结果

五、变异分析

1.NA基因同源性分析 2009年流感病毒代表株和2010年流感病毒分离株共15株，将其NA基因共1410个碱基，用Clustalx 1.83进行序列比对，用BioEdit软件得到15株NA基因的氨基酸相似性矩阵，见表3。2010年分离株和2009年代表株氨基酸相似性较高，介于0.985～0.999。

图4 NA-2片段逆转录PCR电泳结果

表3 NA核酸相似性矩阵

2.NA系统进化树分析 根据NA基因全长序列(1410 bp)，对2009年代表株和2010年分离株共15株甲型H1N1流感病毒株进行了系统进化分析，包括本研究分离到的6株，还有选取的2009年代表株。在系统进化树上，15株毒株分成了3个分支，见图5。

3.氨基酸变异分析 2010年分离的6株甲型H1N1流感病毒的NA基因与2009年中国大陆的代表株比对，6株分离株共有30个碱基位点发生突变，其中有义突变为16个，3个位点和NA活性相关，其中222位氨基酸的变异位于NA活性位点上，未发现H275Y耐药位点的变异，见表4。

图5 甲型H1N1流感病毒NA基因系统进化树

表4 2010年分离株和2009年代表株NA片段氨基酸比对结果

4.糖基化位点变异分析 分别将2010年广州市分离到的6株甲型H1N1病毒株和2009年代表株NA基因进行糖基化位点的预测。结果发现4株甲型H1N1病毒株的糖基化位点和2009年代表株相比并没有明显的变化。

5.NA蛋白结构建模 通过蛋白分析专家系统EXPASY(http://ca.expasy.org/)提供的蛋白组学和序列分析工具SWISS-MODEL，模拟构建各NA蛋白的空间构象。3株病毒株在NA活性位点222位、228位和425位等氨基酸位点处发生了变异，见图6。

图6 NA蛋白三维结构

讨 论

NA蛋白是流感病毒包膜上重要的糖蛋白，能切断细胞表面的唾液酸，促使病毒从感染细胞膜上释放，防止子代病毒自身凝集，促进病毒扩散并增强其感染能力。由于NA在流感病毒复制和传播中起重要作用，且其活性中心的氨基酸组成高度保守，因此是研制抗流感药物的重要靶点。

目前抗流感药物有2种:一种为M2离子通道阻滞剂，如金刚烷胺，但是其副作用很大，而且很容易产生耐药株，有学者报道现在流感病毒对烷胺类的耐药现象十分严重[7-8]。而2009年甲型H1N1流感病毒对烷胺类耐药情况同样严重，主要是在NA第31位氨基酸的变异(S31N)[9]。在这种情况下NA抑制剂成为目前抗流感病毒研究的热点[10]，而且奥司他韦对甲型流感和乙型流感都有效，不易引起耐药性且耐受性好。但是自从奥司他韦应用于临床以来，不断有耐药株出现，耐药率逐年上升，耐药率在成人为0.4% ～1%[11]，在儿童为4% ～8%，其中日本儿童的耐药率高达18%。

流感病毒NA的活性位点结构示意图见图7[12-13]，NA催化位点以及周围相关位点高度保守[14-15]。直接参与催化作用的活性区域有5个，分别为 S1～S5，S1由3个氨基酸残基(R118、R292、R371)组成，S2由2个氨基酸残基(E227、E119)组成，S3由2个氨基酸残基(W178、I222)组成，S4 由3 个氨基酸残基(I222、R224、A246)组成，S5由2个氨基酸残基(A246、E276)组成。间接参与催化作用的位点有 R156、Y406、S179、D198、E228、N294、E425 等氨基酸位点。

图7 流感病毒NA的活性位点结构示意图

这些位点都直接或间接地参与NA的催化，所以此处氨基酸如果发生突变，就会对NA的活性产生影响，减低流感病毒对NA抑制剂的敏感性，甚至会导致对NA抑制剂的耐药。通过对本研究分离到的6株甲型H1N1流感病毒的NA基因的测序，氨基酸序列分析发现部分毒株出现N42S、N59D、Q313K等的氨基酸位点变异，这些均未涉及NA催化位点。但是在A/Guangdong/ZS03/2010(H1N1)毒株中出现E228G氨基酸突变，A/Guangdong/ZS04/2010(H1N1)毒株出现E425G氨基酸突变，这些位点都与NA的活性有关，但这些毒株其耐药性是否有变化，有待进一步研究。

同时在 A/Guangdong/ZS01/2010(H1N1)毒株中出现N222S氨基酸的突变(虽然与文献报道I222位突变的碱基不一样，但是222位氨基酸还是存在突变的)。许多研究表明222位氨基酸的改变会导致流感病毒对 NA抑制剂的耐药[16]。因此需继续对其耐药性密切监测。

从NA三维结构图中可以看到NA活性位点组成一个疏水性的口袋状结构，可以结合NA抑制剂奥司他韦等药物，起到抗病毒的作用。如果疏水性口袋状结构的氨基酸位点发生变异，会导致无法结合奥司他韦等药物，则会产生流感病毒耐药株。尽管结构图中只有少部分氨基酸的突变，但突变位点在NA活性位点上可能对其耐药性产生影响，需后续试验继续研究。

许多研究表明，275位氨基酸的变异会对奥司他韦产生耐药[17]，通过比较分析2010年分离到的甲型H1N1流感病毒，均未发现275位的变异，提示在2010年广州散发的甲型H1N1流感病毒对NA抑制剂仍然敏感。2010年分离株NA糖基化位点与2009年代表株比较并没有变化，与Saxena等[18]的报道相同。同时发现2010年分离株与 2009年代表株同源性较高(0.985～0.999)，提示NA基因仍是同一来源，未发生较大变异。对NA系统进化树分析发现，2009年代表株为一支，而2010年分离株为一支，说明2010年与2009年相比，NA基因有部分碱基发生变异。

通过以上分析，NA蛋白275位氨基酸并未出现变异，提示还没有出现对奥司他韦的耐药株，但是在NA活性中心周围已经存在有变异的氨基酸，可能会对其耐药性有影响。同时随着奥司他韦在临床上的广泛应用，甲型H1N1流感病毒耐药株在世界上其他国家不断有报道，更应该继续加强对甲型H1N1流感病毒的耐药性监测以及序列分析工作，在分子遗传进化分析的基础上，及时发现有流行病学意义的耐药株，为国家制定甲型H1N1流感防控策略提供参考。

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