慢性乙型肝炎患者外周血Th17细胞比例和IL-17表达水平的临床意义

丁庆莉，唐古生，贺铮雯，沈 茜，秦阳华

(第二军医大学附属长海医院实验诊断科，上海 200433)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的乙型病毒性肝炎是我国发病率较高的疾病。在感染HBV的大部分成年人中，表现为一种急性、自限性的肝脏炎症，病毒负荷的急剧下降，长久的保护性体液和细胞免疫，但在另一部分受染的成年人和大多数经垂直传播而致病的患者中，持续的病毒感染会最终导致慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)[1]。然而 HBV 在机体持续性感染致慢性肝炎发生的病理机制尚未完全阐明。HBV是一种非细胞毒性病毒，当其进入机体后常引起一系列复杂的免疫反应，而机体产生的免疫应答的强弱又与HBV感染所致的不同临床结果密切相关。在这一系列免疫应答中，细胞免疫应答是决定HBV感染机体后转归的最重要因素。辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)是近几年发现的辅助性T细胞(CD4+T细胞)新的功能亚群，主要通过分泌大量的白细胞介素17(interleukin 17，IL-17)来发挥生物学效应。目前已证实Th17细胞是急性或慢性炎症环境中重要的效应细胞，在自身免疫性疾病、炎症反应、肿瘤等的发生、发展中均发挥着重要的作用。至今，有关Th17细胞与HBV致肝脏慢性免疫性炎症关系的研究在国内外已见少量报道[2-3]，研究结果均提示Th17细胞可能在病毒性肝炎慢性化过程中具有重要作用。基于上述原因，本研究拟对临床不同疾病程度CHB患者和健康人外周血Th17细胞及其效应分子IL-17的水平进行检测，分析这些变化与患者HBV DNA载量、肝脏损伤标志物等的关系，旨在进一步证实Th17细胞在CHB慢性免疫炎症损伤过程中的作用。

材料和方法

一、研究对象

随机选取2007至2008年在长海医院感染科住院或门诊治疗的93例CHB患者，男68例，女25例，平均年龄(43±15)岁，其中轻度21例、中度37例、重度35例，诊断依据2005年修订的“慢性乙型肝炎防治指南”标准[4]。所有患者没有并发丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人类免疫缺陷病毒感染和自身免疫性肝炎。28名健康者均为长海医院健康体检者，其中男17名，女11名，平均年龄(29±8)岁，无心、肝、肾等器质性疾病，亦无乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人类免疫缺陷病毒感染和自身免疫性疾病。本研究经长海医院医学伦理委员会批准，每位受试对象都签署了知情同意书。

二、标本采集

采集CHB患者血液标本时，有17例接受了核苷类抗病毒治疗，11例未接受任何治疗，其余均仅接受保肝降酶治疗，均未接受甾体类药物治疗。以无菌方式采集各试验对象晨起空腹静脉血，乙二胺四乙酸抗凝血5 mL用于流式细胞仪检测细胞成分分离;不抗凝血5 mL，血清用于检测肝功能、HBV DNA、IL-17 等。

三、外周血Th17细胞和辅助性 T细胞(T helper cell 1，Th1)细胞的流式细胞仪检测

取乙二胺四乙酸抗凝血 100 μL，用 100 μL含10%小牛血清的RPMI-1640培养液(Gibco公司)混合后接种于96孔培养板(Costar公司)，同时加入终浓度为50 ng/mL的佛波醇酯(Sigma公司)、1 μg/mL离子霉素(Sigma 公司)和 1 μL/mL布雷菲德菌素 A(Becton Dickinson公司)。在37℃、5%CO2培养箱刺激培养5 h。收集体外刺激活化的外周血，用磷酸盐缓冲液(phosphatebuffered saline，PBS)洗涤2次。加入5 μL异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)-抗人CD4(eBioscience公司)，室温避光温育30 min。加入1 mL红细胞裂解液(BD公司)室温作用10 min，洗涤。加入固定穿膜剂500 μL(eBioscience公司)，室温作用1 h，洗涤。分别加入5 μL藻红蛋白(phycoerythin，PE)-抗人 IL-17(eBioscience公司)、5 μL 别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)-抗人γ干扰素(interferon-gamma，IFN-γ，eBioscience公司)和同型对照抗体，室温作用30 min，洗涤后立即用FACSCalibur流式细胞仪(BD公司)检测。以CD4+T细胞设门，至少计数20000个细胞，以CellQuest软件分别IL-17和 IFN-γ表达阳性细胞占CD4+T细胞的比例。

四、外周血CD4+T细胞的分离和刺激培养

采用无柱免疫磁珠细胞分选外周血CD4+细胞，试剂盒为 RosetteSep(加拿大 STEMCELL公司)，方法为抗体标记和免疫密度离心负筛选法，具体步骤:取5 mL抗凝全血，加250 μL CD4+T细胞富集试剂后混匀，室温作用20 min，用等量PBS进行稀释并混匀。在另一试管内加入适量淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技公司)，将处理好的标本沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。置水平离心机中，400×g离心20 min。用滴管直接吸出CD4+T细胞层，加入4倍量以上的 Hank’s液，充分混匀，300×g离心10 min。用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液配制细胞悬液，将细胞悬液调整到106/mL。取样经FITC-抗人CD4抗体染色后流式细胞仪检测纯度，代表性结果见图1，纯度＞95%进行下一步试验。按100 μL 2×105/孔的细胞接种96孔培养板，同时加入终浓度为1 μg/mL CD3和2 μg/mL CD28功能性抗体(eBioscience公司)，37℃、5%CO2孵箱刺激培养5 h进行细胞总RNA抽提，培养72 h收集上清液进行酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunoserbent assay，ELISA)检测。

图1 外周血分选CD4+T细胞经抗CD4-FITC抗体标记后流式细胞术检测结果

五、血清和培养上清液IL-17水平的检测

采用ELISA检测，试剂盒购于eBioscience公司，操作严格按试剂盒说明书进行。

六、血清HBV DNA和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)的检测

采用荧光实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测患者血清HBV DNA水平，试剂盒购自深圳匹基生物工程公司。采用速率法检测血清ALT，试剂盒购于科华生物工程公司，仪器为日立7600型全自动生化分析仪。

七、实时荧光定量PCR检测IL-17和维甲酸相关孤儿核受体(RAR-related orphan nuclear receptor C，RORC)mRNA 表达

取1×106个经刺激或未刺激CD4+T细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，逆转录采用 TaKaRa PrimeScriptTMRT试剂盒(TaKaRa公司)进行。再使用 SYBR®Prime-ScriptTMRT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)于Light-Cycler定量PCR仪(Roche公司)进行实时荧光定量PCR。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)mRNA表达量为内参照，根据待检基因和内参照基因扩增的循环数Ct值，按照公式相对值 =2-ΔΔCT计算出标本中待检基因相对于内参照基因的相对含量。引物序列采用Primer Premier 5.0软件设计，IL-17上、下游引物序列:F-TGTCCACCATGTGGCCTAAGAG;R-GTCCGAAATGAGGCTGTCTTTGA。RORC上、下游引物序列:F-ACCTCACCGAGGCCATTCAG;R-TAGGCCCGGCACATCCTAAC。GAPDH上、下游引物序列:F-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC;R-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT。

八、统计学方法

结 果

一、CHB患者外周血Th17细胞比例

与正常对照组[(0.62±0.58)%]相比，CHB患者外周血CD4+IFN-γ－IL-17+T细胞(Th17细胞)的比例[(1.89±1.46)%]明显升高(P ＜0.05)。随着疾病的加重，Th17细胞的比例也随之上升。重度组、中度组和轻度组外周血Th17细胞的比例分别为(2.75 ±2.89)%、(1.75 ±1.58)%和(1.24 ±0.98)%，重度组 Th17 细胞的比例显著高于中度组、轻度组和正常对照组(P＜0.05)，见图2、图 3(a)。CHB 中度组 Th17细胞的比例也显著高于正常对照组(P＜0.05)。然而，中度组Th17细胞的比例与轻度组、轻度组与正常对照组间差异均无统计学意义(P＞0.05)。同时，本研究还观察了CHB患者外周血CD4+IFN-γ+IL-17－T细胞(Th1细胞)的比例变化及与疾病严重度的关系。结果显示，各组间Th1细胞占CD4+T细胞的比例差异无统计学意义(P＞0.05)。见图2、图3(b)。

图2 流式细胞术检测不同疾病程度CHB患者和正常对照组外周血Th17细胞和Th1细胞的比例

图3 不同疾病程度CHB患者与正常对照组外周血Th17细胞和Th1细胞的比例变化

二、CHB患者外周血纯化CD4+T细胞IL-17和核转录因子RORC mRNA表达水平的变化

未经刺激的CD4+T细胞IL-17和RORC mRNA表达水平各组间差异无统计学意义。然而，CD4+T细胞经抗CD3和抗CD28单抗刺激后，CHB重度组IL-17和RORC mRNA表达水平明显高于轻度组和正常对照组(P＜0.05)，且IL-17 mRNA表达在中度组与正常对照组间也存在差异，但CHB重度组与中度组之间、轻度组与正常对照组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)，见图4。

三、CHB患者血清和CD4+T细胞培养液IL-17水平的变化

各组间IL-17水平差异无统计学意义(P＞0.05)，见图 5(a)。随后，测定经纯化的CD4+T细胞刺激后的培养液的IL-17水平。与正常对照组相比，CHB患者CD4+T细胞刺激后的培养液中IL-17水平显著升高(P＜0.05);且随疾病严重程度的增加，IL-17的表达水平亦随之增加。CHB重度组CD4+T细胞刺激后的培养液中IL-17的水平为(4535.69 ±1857.31)pg/mL，明显高于中度组[(2472.01 ±1139.43)pg/mL]、轻度组[(1664.38 ±468.20)pg/mL]和正常对照组[(1421.17 ±471.16)pg/mL](P ＜0.05)，见图5(b)。虽然CHB中度组IL-17水平稍高于轻度组和正常对照组，但差异无统计学意义(P＞0.05);轻度组和正常对照组之间也无差异(P＞0.05)。

图4 不同疾病程度CHB患者和正常对照组外周血纯化CD4+T细胞经功能性抗CD3和抗CD28单克隆抗体刺激后IL-17和RORC mRNA的表达水平

图5 不同疾病程度CHB患者与正常对照组血清和外周血纯化CD4+T细胞经功能性抗CD3和抗CD28单克隆抗体刺激72 h后培养液的IL-17表达水平

四、CHB患者外周血Th17比例与肝脏损伤的关系

CHB患者外周血Th17细胞比例与血清ALT水平呈明显正相关(P＜0.01)，见图6(a)，与血清 HBV DNA载量无相关性(P＞0.05)，见图6(b)。

图6 CHB患者外周血Th17细胞与血清ALT水平及HBV DNA载量的相关性分析

讨 论

肝脏慢性炎症及继发性纤维化是CHB的特征。既往认为CHB患者机体清除病毒能力降低，致使HBV可在体内持续存在，导致HBV感染慢性化的免疫机制与Th1和Th2免疫应答失调有关。CHB患者体内的Th1细胞及其免疫应答降低，IFN-γ和IL-2等细胞因子减少，造成Th1/Th2细胞比例失衡，直接影响了细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)、自然杀伤(natural killer，NK)细胞和B细胞功能的正常发挥。本研究发现CHB组外周血Th1细胞比例与正常对照组无明显差异，且与疾病的严重程度也无关系，表明HBV感染慢性化不是单一因素作用的结果，还存在其他的免疫机制。近来，大量的研究已证实Th17细胞参与了多种肝脏疾病的发生机制，在酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化等疾病中，Th17细胞发挥了诱导固有免疫应答、中性粒细胞趋化激活、产生炎症反应等作用，在对肝脏的损伤及疾病的进展中也均起到重要作用[5-6]。同时，有文献报道Th17细胞不仅可以上调抗凋亡分子，促进被病毒感染的细胞存活，而且可以抑制CTL对靶细胞的破坏，延长病毒持续感染的时间[7]。

有关CHB疾病过程中Th17细胞的变化、与疾病的关系等研究国内外已有一些报道，但试验结果却不尽一致。杨波等[8]发现，CHB组和HBV相关慢加急性肝功能衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)组患者外周血Th17细胞频率均显著高于健康对照组，ACLF组又显著高于CHB组患者。ACLF患者外周血Th17细胞频率与国际标准化比值和终末期肝病模型评分均呈正相关，而CHB患者外周血Th17细胞频率与ALT水平呈正相关，与HBV DNA载量无关。Qi等[9]的研究也得到相似的结果，ACLF患者外周血Th17细胞频率和RORC mRNA表达水平显著高于CHB组，而CHB组则显著高于健康对照组。然而，Zhang等[10]发现CHB患者外周血增加的Th17细胞频率与ALT水平及HBV DNA载量均呈正相关。林振忠等[11]也发现CHB患者Th17细胞的频数明显高于健康对照组，但与总胆红素、直接胆红素和ALT无相关性。本研究结果显示CHB患者外周血Th17细胞比例明显高于正常对照组，且随着疾病的加重，Th17细胞的比例也随之上升，表现为重度组Th17细胞比例明显高于中度组、轻度组和正常对照组，中度组Th17细胞比例也显著高于正常对照组。为了进一步明确CHB患者外周血Th17细胞比例的检测结果，我们还对Th17细胞分化特异性核转录因子RORC mRNA的表达水平进行了检测，所获的结果完全佐证上述发现。升高的Th17细胞比例是否与肝脏损伤存在一定的关联?我们发现CHB患者外周血Th17细胞的比例与血清ALT水平呈明显正相关，而与血清HBV DNA载量无相关性，这与杨波等[8]的报道完全一致。Ye等[12]已证实，CHB患者肝内Th17细胞数量与肝脏炎症活动度呈正相关，该报道也是对本研究结果的有力支持。各文献报道结果有差异，原因可能与CHB患者病例的入选条件不同有一定关系。在本研究和杨波等的报道中均将CHB按疾病严重程度进行分组，其中重度组的病例数均﹥30例;而在林振忠等[11]的报道中均为CHB病例，如均为轻度患者，就较难观察到外周血Th17细胞比例与ALT变化的关联性。

IL-17是Th17细胞分泌的特征性炎性细胞因子，具有广泛的细胞靶点，可诱导其他炎性细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的表达，参与中性粒细胞趋化，引起炎性细胞浸润和组织损伤[5，13]。国内外文献报道，CHB、肝硬化、原发性肝癌和慢性肝功能衰竭患者血清IL-17和外周血单个核细胞IL-17 mRNA水平均比正常对照显著升高，在CHB和肝硬化患者的肝组织中IL-17的表达也明显增多[8，10-12，14]。然而，这些结果并未获得一致的支持，一些研究发现CHB患者血清IL-17水平与正常对照者比较无明显差异[15-16]。本研究结果也显示CHB患者血清IL-17水平与正常对照者比较无明显差异。但分析试验对象纯化CD4+T细胞刺激后的培养液时发现，CHB患者CD4+T细胞刺激后的培养液中IL-17的水平明显高于正常对照者，且随疾病严重程度的增加而增高。试验对象纯化CD4+T细胞经功能性抗CD3和抗CD28单克隆抗体模拟T细胞抗原受体激活CD4+T细胞时，CHB尤其是CHB重度和中度组患者CD4+T细胞趋向于分化更多的Th17细胞，致培养液中IL-17的水平高于正常对照组和CHB轻度组。关于CHB患者血清中IL-17检测结果的差异，我们认为可能与Th17细胞在血循环中所占比例甚少，及CHB患者多存在T细胞免疫功能抑制有关。

综上所述，本研究的结果提示CHB患者体内增高的Th17细胞可能是造成肝脏炎症、促进肝细胞损伤的主要原因之一，并与CHB的重症化密切相关。调节性T细胞从CD4+T细胞分化而来，在分化中所需的部分细胞因子与Th17细胞比较类似，然而生物学功能却存在一定的拮抗。若能增加未治疗患者病例数，按治疗与否和不同治疗方案分组，并做治疗前后相关指标的比较，则可分析不同治疗方案对相关指标的影响，以期探讨可用于评价治疗效果的指标。如果在本研究中能够同时分析调节性T细胞的比例及相关转录因子、效应分子等的变化，将有助于更全面地了解CHB患者的机体免疫状态。外周血Th17细胞比例升高可否作为CHB患者疾病进展的标记?Th17细胞是否可成为治疗CHB的一个新靶点?哪些因素驱动或参与了CHB患者Th17细胞的分化?这些问题均有待于进一步探索。

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