鸽TLR7基因的克隆、鉴定及表达分析

韩 翡，焦培荣，韦良孟，2，何 静，宋亚芬，康银峰，崔 进，张 烁，廖 明，任 涛

(1华南农业大学兽医学院/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州 510642;2山东农业大学动物医学院，山东泰安 271018)

鸽TLR7基因的克隆、鉴定及表达分析

韩 翡1，焦培荣1，韦良孟1，2，何 静1，宋亚芬1，康银峰1，崔 进1，张 烁1，廖 明1，任 涛1

(1华南农业大学兽医学院/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州 510642;2山东农业大学动物医学院，山东泰安 271018)

【目的】克隆鸽Toll样受体(Toll-like receptor 7，TLR7)全基因，预测其主要功能区域并分析在鸽的各种组织中的表达情况.【方法】通过RT-PCR、RACE、相对荧光定量PCR、生物信息学软件分析方法进行研究.【结果和结论】研究发现鸽TLR7基因cDNA全长3 516 bp，ORF全长3 175 bp，编码1 048个氨基酸.其蛋白结构主要由胞外的富含亮氨酸的结构域(LRRs)、跨膜域(TM)和胞内的Toll/白介素-1受体结构域(TIR)3部分构成.鸽TLR7基因编码的氨基酸序列与鸿雁Anser cygnoides、绿头鸭Anas platyrhynchos、鸡Gallus gallus和麻雀Taeniopygia guttata的相似性均高于78%，与哺乳动物的相似性约为60%，与鱼类的相似性低于55%.鸽TLR7基因在小肠、脾脏、肾脏、肝脏中表达量较高，而在大脑、肺脏、气管、心脏、胰腺、肌肉、皮肤中表达量相对较低.该研究克隆了鸽TLR7全基因，并预测其主要功能区域.

鸽;TLR7基因;序列分析;受体表达

Toll样受体家族(Toll like receptors，TLRs)是一类介导天然免疫的模式识别受体，通过识别病原相关模式分子，激活信号通路，调控炎症因子的释放，从而在天然免疫防御中发挥重要作用［1］.TLRs属于Ⅰ型跨膜蛋白，可以分为3部分：胞外区(Extracellular domain，ECD)、跨膜区(Transmembrane domain，TM)和胞内区(Toll/IL-1 receptor domain，TIR).胞外区负责识别病原微生物相关的分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，其是由19～25个串联的富亮氨酸重复(Leucine-rich repeat.LRR)形成的结构域［2］.Toll样受体7(Toll-like receptor 7，TLR7)能够识别病原微生物的ss RNA和部分短的ds RNA［3-4］.Toll样受体7基因(TLR7)广泛存在于DC、B细胞、单核细胞、NK细胞和T细胞等免疫细胞中［5-6］.近年来，人类TLRs与病原微生物的相互作用研究取得了重大进展.同时，猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅等家畜的TLR7基因已被成功克隆［7-8］，并对其中某些分子的功能进行了深入研究［9-10］.而鸽TLRs基因的克隆和功能预测以及其在宿主防御病原微生物中的作用研究较少.因此本研究将利用RACE方法克隆鸽TLR7基因，并预测其主要功能区，为其深入研究奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

RNA抽提试剂盒RN easy plus Mini(50)为Qiagen公司产品;反转录酶 M-MLV Reverse Transcriptase、T载体(pMD19-T vector)、dNTP、ExTaq酶、3'RACE试剂盒、5'RACE试剂盒、SYBR® Premix ExTaqTM(Perfect Real Time)均为大连宝生物(TaKaRa)公司产品;核酸染料(EB替代)为Bioteke公司产品;胶回收试剂盒为Tiangen公司产品;pfx高保真聚合酶为Invitrogen公司产品;T4 DNA连接酶为NEB公司产品;DNA Marker为东盛生物公司产品;大肠埃希菌DH5α由华南农业大学禽病室保存.

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根据GenBank中已公布TLR7基因序列，鸡(Gallus gallus， NM_001011688.2)、鸭(Anas platyrhynchos，DQ888645.1)、人(Homo sapiens，NM _016562.3)、小鼠(Mus musculus，NM_133211.3)等序列为参考序列，应用Oligo 7(Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，CO)设计简并引物.中间片段S1扩增的简并引物F1/R1.根据已知参考序列和已经扩增的S1序列设计F2/R2和F3/R3.引物由英潍捷基(广州)贸易有限公司(Life technologies)合成.本试验所用引物如表1所示.

表1 试验所用引物Tab.1 PCR primers used in this study

1.2.2 总RNA的提取及反转录 取30 mg新鲜鸽子脾脏，按照QIAGEN公司的RNA easy mini kit使用说明书进行总RNA抽提.取总RAN 41 μL，加入RNA酶抑制剂1 μL，5×buffer 16 μL，随机引物(Random primer和Oligo d T的混合物)4 μL，dNTP 16 μL，M-MLV反转录酶2 μL，42℃反应60～120 min;70℃条件下作用15 min终止反应.

1.2.3 中间片段S1的PCR扩增与序列测定 按照ExTaq酶说明书的推荐体系，扩增TLR7基因中间片段(S1).PCR反应条件：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min(1 kb/min)，35个循环;72℃延伸7 min，4℃结束反应.

PCR反应产物用DNA凝胶纯化试剂盒回收.回收产物克隆到pMD19-T载体，挑取单克隆，菌液PCR法筛选疑似阳性克隆，送测序.

1.2.4 中间片段S2和S3的PCR扩增与序列测定

扩增方法同S1的扩增.

1.2.5 3'端扩增(3'RACE) 根据获得的S3片段设计3'RACE上游引物：GSP1和GSP2;按TaKaRa公司3'RACE试剂盒说明书进行操作.获得TLR7基因3'末端完整序列.

首先进行反转录反应：按照说明书推荐体系和程序进行反转录.然后进行PCR反应.一轮PCR：50 μL反应体系为10× PCR Buffer 4 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，TaKaRaTaq(5 U/μL)0.25 μL，GSP1 0.5 μL，3'Adaptor primer 0.5 μL，上述反转录液1 μL，ddH2O 40.75 μL;PCR反应条件为94℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环;72℃延伸7 min，4℃结束反应.二轮PCR反应条件同一轮PCR.产物用DNA凝胶纯化试剂盒回收，产物连接于pMD19-T载体上，筛选出疑似阳性菌送英潍捷基(广州)贸易有限公司测序.

1.2.6 5'端扩增(5'RACE) 根据获得的S2片段设计5'RACE下游引物：5'RACE-R5和5'RACER4，按5'RACE(TaKaRa)试剂盒说明书进行操作(类似于3'RACE).

1.2.7TLR7基因的生物信息学分析 使用Laser gene Edit seq软件对扩增出的片段进行拼接，得到鸽TLR7基因完整序列.使用Meg Align软件分别对鸽TLR7基因氨基酸序列与其他动物的TLR7基因氨基酸序列进行相似性分析、进化树分析.通过NCBI Conserved Domain Database(CDD)在线数据库对鸽TLR7基因进行结构和功能预测.

1.2.8 实时荧光定量PCR检测鸽TLR7基因组织分布 采集健康鸽的组织(大脑、气管、肺脏、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、小肠、肌肉、皮肤、法氏囊)为试验材料，按照QIAGEN公司的RNA easy mini kit使用说明书抽提总RNA，反转成cDNA，以其作为模板，以法氏囊作为参比组织，以鸽β-actin作内参基因.使用TaKaRa公司的SYBR®Premix ExTaqTM(Perfect real time)试剂盒，反应体系为：2×SYBR Green mix 10 μL，上下游引物各0.2 μL，模板cDNA 1 μL，补去离子水至20 μL，每个样做3个重复.

实时定量 PCR在 ABI7500检测系统上进行，PCR反应程序：95℃ 预变性5 min;95℃变性15 s，60℃退火加延伸34 s(收集荧光信号)，共40个循环.反应完成后进行熔解曲线分析.程序结束后系统自动生成各个样品的Ct值和产物的退火温度值.

1.2.9 数据处理与分析 靶基因与内参基因(β-actin)的比率计算根据2-△△Ct公式［11］.统计分析使用Graph Pad Prism 5软件(Graph Pad Software Inc，San Diego，CA).

2 结果与分析

2.1 鸽TLR7基因的中间片段PCR克隆结果

分别用引物F1和R1扩增得到931 bp的S1片段;引物F2和R2扩增得到929 bp的S2片段;引物F3和R3扩增得到601 bp的S3片段.BLAST对比结果显示这3个片段与鸡和鸭的TLR7基因相似性较高，说明得到正确的鸽TLR7基因的部分片段(图1a～1c).

2.2 鸽TLR7基因的3'RACE和5'RACE PCR克隆结果

通过3'RACE获得大小为476 bp的3'末端片段，其含有18个A组成的 poly(A)尾，得到了鸽TLR7基因的3'末端完整序列.通过5'RACE获得大小为358 bp的5'末端完整序列(图1d～1e).

2.3 鸽TLR7基因的序列分析

将各序列拼接后得到3 516 bp的鸽TLR7基因全长cDNA序列.序列分析发现鸽TLR7基因的最长开放阅读框为3 175 bp，编码1 048个氨基酸，相对分子质量为122 370.3，等电点(PI)为8.74.结合SMART(图2)和TMpred Server分析预测鸽TLR7蛋白质二级结构包含有典型的LRR、TM和TIR区.

2.4 鸽TLR7基因的分子遗传进化分析

氨基酸同源对比发现，鸽TLR7基因编码的氨基酸序列与雁属类相似性最高，其中与鸿雁Anser cygnoides和绿头鸭Anas platyrhynchos的相似性分别为81.7%和80.7%，而与鸡和麻雀Taeniopygia guttata的相似性次之，分别是78.5%、78.9%，但与灵长类和其他哺乳动物的相似性相对较低，在60.5% ～65.5%之间，与鱼类的相似性则低于55%.从进化树分析发现，鸽TLR7与麻雀TLR7基因编码的氨基酸序列处于同一分支上，亲缘关系最近;另外，鸽TLR7基因编码的氨基酸序列与麻雀、鸡、鸿雁、绿头鸭的均处于同一大分支上，亲缘关系较近，而与灵长类和其他哺乳动物亲缘关系相对较远，与鱼类的亲缘关系最远(图3).

图1 鸽TLR7基因部分序列鉴定电泳图Fig.1 Electrophoresis of partial sequence of pigeon TLR7

图2 鸽TLR7蛋白质二级结构Fig.2 The protein secondary structures of pigeon TLR7

图3 鸽TLR7氨基酸序列遗传进化树Fig.3 Phylogenetic tree of TLR7 amino acid sequence

2.5 鸽TLR7基因在正常组织中的分布情况

通过荧光定量PCR检测发现TLR7基因在健康鸽小肠中的表达量最高，在脾脏、肾脏、肝脏中表达量相对较高，在气管、心脏、胰腺、皮肤中表达量相对较低，在大脑、肺脏、肌肉中表达量最低(图4).

图4 定量分析鸽TLR7基因在健康组织中的分布Fig.4 Quantitative analysis of tissue distribution of TLR7 gene transcripts in pigeons

3 讨论

模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)是机体抵御病原微生物感染，启动机体天然免疫的重要组成部分，在先天性免疫中发挥了重要作用［12］.病原微生物感染细胞后，PRRs通过识别病原的病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，促使下游干扰素和细胞因子的分泌，激活一些抗细菌或抗病毒蛋白的表达，启动天然免疫应答［13］.

人类 TLRs家族主要由 TLR1、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR11这6个主要亚家族成员构成.其中TLR7亚家族由TLR7、TLR8和TLR9构成.鸡的Toll样受体(ch TLRs)和人类相似，其 chTLR2、chTLR4、chTLR5、chTLR7已经被发现.分析比较鸡和人类基因组信息，发现鸡的表达序列标签(Expressed sequence tags，ESTs)和人TLR1/6/10、TLR2、TLR3、TLR5、TLR7相关序列高度同源.目前，研究表明在鸡中至少存在8种TLRs［14］.

本研究根据已公布的部分物种的TLR7基因序列为参考序列设计简并引物扩增部分片段，获得鸽TLR7基因的部分保守序列，再结合cDNA末端快速扩增技术RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)及生物信息学分析等技术，获得鸽TLR7基因的全长序列.

利用SMART预测鸽TLR7基因的功能区，发现其含有典型的TLRs家族结构，分子结构由胞外区、跨膜区和胞内区组成，从N端到C端依次包括信号肽、LRR、1个富含半胱氨酸的结构域、跨膜区以及胞内区.与其他物种的氨基酸序列比较，发现鸽与鸿雁、绿头鸭、鸡、麻雀的氨基酸序列相似性均较高.从进化分析结果显示，鸽TLR7基因与麻雀亲缘关系最近;鸽、麻雀、鸡、绿头鸭的TLR7基因位于同一进化分支，这表明它们的亲缘关系较近.但其与哺乳动物亲缘关系相对较远，与鱼类亲缘关系最远.

本研究利用荧光定量PCR方法检测鸽TLR7基因在健康组织中的表达，发现在小肠、脾脏、肾脏、肝脏中表达量较高，而在大脑、肺脏、肌肉、心脏中表达量较低.因此，鸽TLR7基因在不同组织中的表达存在差异.

在哺乳动物中，TLR7受体能识别多种小分子抗病毒化合物以及病毒单链RNA，通过MyD88依赖的信号通路诱导促炎症因子和I型干扰素的产生，介导机体抗病毒免疫应答，同时TLR7活化促进树突状细胞(Dendritic cells，DC)表达共刺激分子和趋化因子受体，延长DC体外存活时间，增强淋巴细胞增殖能力，因而它在天然免疫和获得性免疫中起到桥梁的作用.在鸟类中，病毒的单链RNA是TLR7受体可识别的配体之一，因此，鸟类对病毒的易感性可能与相识别的配体有关.ch TLR7和相应配体结合后会刺激细胞产生一系列细胞因子和抗病毒蛋白的表达，包括ch IL-18、ch IL-6、ch IL-8和NOSⅡ等［15］.但关于TLR7介导的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节机制还不清楚，还有待深入研究.

基于TLR7基因在抗病毒天然免疫中的重要作用，本研究克隆了鸽TLR7基因，用生物信息学方法进行了序列分析，并预测其主要功能区域，为深入研究其识别病原相关分子模式的机制奠定基础.

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【责任编辑 柴 焰】

Molecular cloning，characterization and expression analysis of the pigeon toll-like receptor 7 gene

HAN Fei1，JIAO Peirong1，WEI Liangmeng1，2，HE Jing1，SONG Yafen1，KANG Yinfeng1，CUI Jin1，ZHANG Shuo1，LIAO Ming1，REN Tao1
(1 College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University/National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control/Key Laboratory of Animal Vaccine Development，Ministry of Agriculture/ Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong，Guangzhou 510642，China; 2 College of Veterinary Medicine，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China)

【Objective】To clone and characterize the pigeon Toll like receptor 7(TLR7)gene.【Method】RT-PCR，RACE(rapid amplification of cDNA ends)，Quantitative real-time PCR and bio-informatics software was used in this study.【Result and conclusion】The study showed that the full-length of pigeonTLR7 cDNA sequence was 3 516 bp with the longest open reading frame(ORF)of 3 175 bp encoding a peptide of 1 048 amino acids.The deduced amino acid sequence of pigeonTLR7 contained three main structural domains including an extracellular leucine rich repeats domains(LRRs)，a transmembrane domain(TM) and a Toll/IL-1 receptor domain(TIR);pigeonTLR7 shared amino acid sequence similarity with theAnser cygnoides TLR7 gene，Anas platyrhynchos TLR7 gene，Gallus gallus TLR7 gene(above 78%)，mammalTLR7 gene(about 60%)，and fishTLR7 gene(less than 55%).Quantitative real-time PCR analysis revealed that the pigeonTLR7 mRNA widespread expression in the tested tissues was high in small intestine，spleen，kidney and low in brain，lung，trachea，heart，pancreas，muscle and skin.In this studyTLR7 gene has been isolated from pigeon，cloned and its main functional domains have been predicted.

pigeon;TLR7 gene;sequence analysis;receptor expression

S855

A

1001-411X(2014)03-0018-06

2013-10-13 优先出版时间：2014-03-31

优先出版网址：http:∥www.cnki.net/kcms/doi/10.7671/j.issn.1001-411X.2014.03.004.html

韩 翡(1989—)，女，彝族，硕士研究生，E-mail:vshanfei@foxmail.com;通信作者:焦培荣(1974—)，男，副研究员，博士，E-mail:prjiao@yahoo.com;任 涛(1968—)，男，教授，博士，E-mail:rentao@scau.edu.cn

国家自然科学基金(31172343，31072139，31372412);公益性行业(农业)科研专项(201303033)

韩 翡，焦培荣，韦良孟，等.鸽TLR7基因的克隆、鉴定及表达分析［J］.华南农业大学学报，2014，35(3)：18-23.