乌梅等20种中药对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性研究

康 帅，殷中琼，贾仁勇，2，代如意，李 莉，彭练慈，曲 径，梁 陈

(1四川农业大学动物医学院，四川雅安 625014;2四川农业大学预防兽医研究所，四川雅安 625014)

乌梅等20种中药对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性研究

康 帅1，殷中琼1，贾仁勇1，2，代如意1，李 莉1，彭练慈1，曲 径1，梁 陈1

(1四川农业大学动物医学院，四川雅安 625014;2四川农业大学预防兽医研究所，四川雅安 625014)

【目的】观察乌梅Fructus mume等20种中药的体外抗胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性.【方法】通过乙醇回流、水煎煮和超声波等方法对20种中药进行提取，采用二倍稀释法测定其对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性;并研究抗菌活性较强的几味中药的体外联合抑菌活性.【结果和结论】乌梅、黄连Rhizoma coptidis、诃子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6种中药提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)范围是6.25～50.00 mg/mL;大青叶Isatis indigotica、茵陈Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鲜皮Dictamnus dasycarpus 4种中药提取物的MIC范围是50.00～100.00 mg/mL;黄柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金银花Lonicera japonica、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板蓝根Baphicacanthus cusia、栀子Gardenia jasminoides和黄芪Astragalus membranaceus等10种中药提取物的MIC＞100.00 mg/mL.联合抑菌试验结果表明，乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合抑菌指数(FICI)≤1，乌梅、虎杖分别与秦皮的FICI＞2.乌梅、黄连、诃子、虎杖、秦皮、地榆对胸膜肺炎放线杆菌均具有较好的体外抗菌活性;乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合为相加、协同作用;秦皮分别与乌梅、虎杖为拮抗作用.

乌梅;黄连;诃子;虎杖;胸膜肺炎放线杆菌;抗菌活性

胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae属巴氏杆菌科嗜血杆菌属，后根据其表型和DNA杂交水平均与放线杆菌属模式种密切相关，归属为巴氏杆菌科放线杆菌属.常与巴氏杆菌等混合感染［1］，是引起猪上呼吸道感染的主要病原菌之一.主要引起猪传染性胸膜肺炎，表现为急慢性炎症，急性死亡率较高，常伴随猪繁殖与呼吸综合征病毒感染，是一种高度传染性疾病［2-3］.目前猪传染性胸膜肺炎的治疗主要采用抗菌药物，如氟苯尼考、盐酸环丙沙星等，大量抗菌药物的使用，增加了胸膜肺炎放线杆菌的耐药性，同时由于抗菌药物的滥用，造成药物残留和环境污染等诸多社会问题.针对抗菌药物所带来的诸多问题，兽医临床急需寻找低毒有效的抗菌药物替代品，以控制疾病的发生.据研究报道，中药或天然植物提取物，可发挥对病原菌的直接杀灭作用不产生耐药性［4-5］.因此如何从中药中寻找抗胸膜肺炎放线杆菌新药已经成为药物开发的热点.本研究选择乌梅、黄连等20种具有抗菌活性的中药，提取其不同部位，研究其对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性，以期为筛选得到对胸膜肺炎放线杆菌具有抗菌作用的中药及其复方奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

乌梅Fructus mume(产地四川，批次：120315)、黄连Rhizoma coptidis(产地四川，批次：080406)、诃子Terminalia chebula(产地云南，批次：081121)、虎杖Polygonum cuspidatum(产地四川，批次：081102)、柴胡Bupleurum chinense(产地甘肃，批次：080301)、板蓝根Baphicacanthus cusia(产地甘肃，批次：080921)、黄柏Phellodendron amurense(产地四川，批次：080923)、大青叶Isatis indigotica(产地四川，批次：100310)、杜仲Eucommia ulmoides(产地云南，批次：080916)、蒲公英Taraxacum mongolicum(产地贵州，批次：100217)、白鲜皮Dictamnus dasycarpus(产地辽宁，批次：080914)、茵陈Artemisia capillaris(产地河北，批次：080923)、秦皮Cortex fraxini(产地山西，批次：100330)、栀子Gardenia jasminoides(产地广西，批次：080622)、黄芪Astragalus membranaceus(产地陕西，批次：040824)、鱼腥草Houttuynia cordata(产地四川，批次：100310)、甘草Glycyrrhiza uralensis(产地甘肃，批次：081102)、夏枯草Prunella vulgaris(产地河南，批次：101114)、地榆Sanguisorbae officinalis(产地陕西，批次：040827)、金银花Lonicera japonica(产地四川，批次：080919)20种中药均购于四川雅安惠民堂药业连锁有限责任公司，由四川农业大学药学系副教授范巧佳鉴定为正品.

胸膜肺炎放线杆菌(ATCC265)，购买于中国兽药监察所.含质量分数为0.02%烟酰胺腺嘌呤二核甘酸(NAD)的 TSB液体培养基、含质量分数为0.02%NAD的TSA固体培养基.96微孔细胞培养板、SPX型生化培养箱、旋转蒸发仪、索氏提取器等.

1.2 方法

1.2.1 20种中药有效部位的提取 乌梅、黄连、诃子、虎杖等20种中药按文献［6-19］的方法进行有效部位的提取，压缩烘干成浸膏.

1.2.2 药液制备 将20种中药提取物浸膏溶于二甲基亚砜中，配制成质量浓度为1 g/mL的储备液，高压蒸汽灭菌，4℃冰箱保存.

1.2.3 有效部位抗菌活性研究 参照美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)推荐的对细菌敏感性检测方案，采用试管二倍稀释法，测定20种中药有效部位提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC);用TSA琼脂平板涂板法测定20种中药有效部位提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小杀菌浓度(Minimal bactericidal concentration，MBC).

菌液制备：采用平板菌落计数法确定菌液浓度.将胸膜肺炎放线杆菌菌液进行10倍系列稀释，分别取不同稀释度的菌液0.1 mL滴加于含质量分数为0.02%NDA的TSA平板上，用无菌涂布器涂布均匀，每稀释度重复2块平板，37℃温箱中培养18～24 h.选取菌落数在30～300个的平板进行计数，每组稀释度相同的平板取平均值作为菌落数.计算出原菌液细菌浓度，作为细菌菌液的标准浓度.

药敏试验方法：采用试管二倍稀释法.取无菌试管16支，分为试验组和对照组，每组8支.分组编号后向试验组8支试管中各加l mL TSB肉汤，以无菌操作吸取已稀释好的药物1 mL加入第1管，混匀后依次倍比稀释至第7管，混匀后自第7管弃去l mL，此时试管内药液浓度比依次为1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128，相当于药液质量浓度为500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.60、7.80 mg/mL，第8管不加药物为对照组管.对照组操作同试验组.用微量加样器取已校正浓度的菌液0.1 mL，依次由低浓度向高浓度加到试验组各管中，混匀后，置于37℃培养箱培养18～24 h后分别观察细菌的生长状况，以浑浊度为指标，以对照组为参考对象检查试管中有无细菌生长，以药物最低浓度管中无细菌生长者为该试验菌MIC.将MIC测定中判定未生长细菌的试验组中药肉汤1 mL涂布于TSA琼脂平板上，37℃条件培养18～24 h，观察结果，以细菌菌落个数不超5个的管内的药物浓度，为该药的MBC［20］.

1.2.4 联合抑菌活性的研究 根据前期20味中药有效部位体外MIC的测定，选取其中抗菌活性较强的几味中药进行两两联合抑菌活性的研究.

溶液配制：精确称取抗菌活性较强的几种中药提取物0.20 g，溶于1 mL无菌蒸馏水中，超声仪上超声使其充分溶解，配制成质量浓度为 200.00 mg/mL的药物母液，灭菌，4℃冰箱保存.

联合用药选择药物的起始浓度约为2 MIC，用TSB培养液对上述药液进行倍比稀释，使配方中提取物的初始浓度为2 MIC，终末浓度为1/64 MIC.

药敏试验：将无菌96孔板在超净台用紫外灯照射30 min，以棋盘稀释法8孔稀释.单用药物于药敏板第1孔分别向右向下倍比稀释，各8孔，每孔100 μL，第1排第9孔为空白对照，第1排第10孔为生长对照.联合用药药敏板则分别在每孔依次加2种药物各50 μL，向右向下2倍稀释.药物灌板后，按药敏板的布局，每孔加入100 μL菌悬液.将药敏板置于微量振荡器上振荡，使其充分混匀，37℃条件下培养18～36 h，置于有水环境中保持液量.

各味中药药敏试验判定标准：参考刘忠义等［21］介绍的判断标准，MIC＜7.80 mg/mL，为高度敏感; 7.80 mg/mL＜MIC＜250.00 mg/mL，为中度敏感; MIC＞250.00 mg/mL，为不敏感.

联合用药效果评价：试验结果以联合抑菌指数(Fractiona inhibitory concentration index，FICI)来判断联合效应，表示为FICI=MIC(A)联合/MIC(A)单独+MIC(B)联合/MIC(B)单独，其中，A，B分别表示2种中药种类.

当FICI≤0.50时为协同作用;0.50＜FICI≤1.00时为相加作用;1.00＜FICI≤2.00时为无关作用;FICI＞2.00时为拮抗作用.

2 结果

2.1 20种中药提取物的抗菌活性

由表1可知，20种中药有效部位提取物中体外抑菌活性最强的为黄连、诃子和乌梅3种中药，MIC均为15.60 mg/mL，其次为秦皮、地榆和虎杖3种中药，MIC为31.25 mg/mL，抗菌活性稍差的是白鲜皮、茵陈、大青叶和甘草4种中药，MIC为62.50 mg/mL，抗菌活性最差的为柴胡和夏枯草，MIC为125.00 mg/mL.由此可见，黄连、乌梅等12味中药对胸膜肺炎放线杆菌表现为中度敏感.黄柏、金银花、板蓝根等8种中药，MIC均为250.00 mg/mL，无抑菌活性，为不敏感.另外，黄连MBC为15.60 mg/mL，乌梅和虎杖MBC为31.25 mg/mL，诃子、秦皮、地榆和大青叶MBC为62.50 mg/mL，具有较强的杀菌活性，黄柏、蒲公英等13味中药MBC≥125.00 mg/mL，表现出较弱杀菌活性.因而笔者选取抗菌活性较强且报道较少的乌梅、黄连、诃子、秦皮和虎杖5味中药提取物进行后续的联合抑菌活性的研究.

2.2 5种中药提取物的联合抑菌活性

5种中药提取物两两联合的抑菌活性结果见表2，根据联合抑菌指数(FICI)评价两者的联合效应.从表2可以看出，乌梅和秦皮、秦皮和虎杖FICI＞2.00，为拮抗作用;乌梅和黄连、黄连和诃子、黄连和秦皮、诃子和虎杖及黄连和虎杖FICI≤0.50，为协同作用;乌梅和诃子、乌梅和虎杖、诃子和秦皮0.50＜FICI≤1.00，为相加作用.

表1 20种中药提取物体对胸膜肺炎放线杆菌体外抗菌活性Tab.1 Antimicrobial activity of active ingredient extract of twenty traditional Chinese medicines against Actinobacillus pleuropneumoniae

表2 5味中药提取物两两联合抑菌活性结果1)Tab.2 Joint antimicrobial activity of active ingredient extract of five traditional Chinese medicines against Actinobacillus pleuropneumoniae mg·mL-1

3 讨论

试验采用二倍稀释法进行胸膜肺炎放线杆菌的体外抑菌试验.由于中药成分复杂，不同提取方法对抑菌活性有很大影响，本试验主要根据文献［6-19］中最佳提取工艺对中药有效部位进行提取，然后测定中药的MIC值.

据LIU等［22］报道，氟苯尼考、头孢噻呋等化学药物对胸膜肺炎放线杆菌疗效显著，普遍用于胸膜肺炎放线杆菌的治疗，而Yoshimura等［23］检测了16种抗菌化学药物对不同血清型胸膜肺炎放线杆菌体外抑菌活性，发现氟喹诺酮类和头孢噻呋对胸膜肺炎放线杆菌抗菌活性较好，青霉素、黏菌素等抗生素对胸膜肺炎放线杆菌效果较弱，而且不同血清型胸膜肺炎放线杆菌都对它们产生了不同程度耐药性.

本研究检测到的黄连、诃子和乌梅 MIC均为15.60 mg/mL，秦皮、地榆和虎杖 MIC均为31.25 mg/mL，同时，黄连、乌梅、虎杖、诃子、秦皮和地榆MBC≤62.50 mg/mL，说明了黄连、诃子和乌梅等6种中药中有效部位有较强的抑杀菌作用.据葛冰等［24］报道，将黄芪、桑白皮、陈皮和连翘4种中药进行组方后试验，发现这些组合无毒副作用，无污染，无药物残留，超微粉碎后生物利用度高，疗效显著，临床对猪胸膜肺炎放线杆菌有特效.刘仁志等［25］利用大蒜挥发油及其复方对胸膜肺炎放线杆菌进行体外抑菌试验，证明大蒜挥发油及其复方MIC为3.90 mg/mL，MBC为7.80 mg/mL有较强的抗菌活性.而宋波等［26］、蔡小华等［27］报道，黄连、乌梅、诃子、虎杖等对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎球菌等体外抑菌结果表明其MIC在7.80～250.00 mg/mL之间，为中度敏感，说明6种中药活性部位能增强对细菌的抑菌作用.本试验研究表明黄连、乌梅和诃子等6种中药对胸膜肺炎放线杆菌有较强抗菌作用，为后续药物研究开发提供基础.

联合抑菌试验显示，黄连与乌梅、秦皮、诃子、虎杖联合都产生协同作用，具有良好的抗菌作用.但由于黄连主要成分为盐酸小檗碱，在配伍时能与大多数中药形成沉淀，影响抗菌活性［28］，同时由于诃子含有大量鞣质，在进行体外抑菌试验时也会出现沉淀，影响试验结果观察.因此，在进行含有黄连和诃子的相关试验中应优化提取工艺，以减少沉淀的产生.而在联合抑菌试验中，秦皮与乌梅、虎杖都呈拮抗作用，具体作用机制有待进一步验证.

本研究表明，黄连、乌梅、诃子、虎杖、秦皮等中药对胸膜肺炎放线杆菌具有较好的抗菌活性，黄连和乌梅、虎杖以及诃子呈协同或相加作用，研究结果为筛选治疗胸膜肺炎放线杆菌病中药新药具有重要意义.

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【责任编辑 柴 焰】

A study on antibacterial activity of crude extract from twenty traditional Chinese medicines like Fructus mume against Actinobacillus pleuropneumoniae in vitro

KANG Shuai1，YIN Zhongqiong1，JIA Renyong1，2，DAI Ruyi1，LI Li1，PENG Lianci1，QU Jing1，LIANG Chen1
(1 College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China; 2 Preventive Veterinary Research Institute，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China)

【Objective】The antibacterial activity of twenty traditional Chinese medicines againstActinobacillus pleuropneumoniae in vitrowas evaluated in this study.【Method】Twenty traditional Chinese medicines likeFructus mumewere extracted by ethanol reflux extraction，water decoction and ultrasonic wave.Minimal inhibitory concentrations(MICs)of twenty traditional Chinese medicines againstA.pleuropneumoniaewere determined by the macrodilution broth method.The joint antimicrobial activity of some traditional Chinese medicines was evaluatedin vitro.【Result and conclusion】The results showed that the MICs of the extract obtained fromF.mume，Rhizoma coptidis，Terminalia chebula，Cortex fraxini，Sanguisorbae officinalisandPolygonum cuspidatumagainstA.pleuropneumoniaeranged from 6.25 to 50.00 mg/mL.MICs of the extract obtained fromIsatis indigotica，Artemisia capillaris，Glycyrrhiza uralensisandDictamnus dasycarpusranged from 50.00 to 100.00 mg/mL.MICs of the extract obtained fromPhellodendron amurense，Eucommia ulmoides，Lonicera japonica，Bupleurum chinense，Taraxacum mongolicum，Baphicacanthus cusia，Gardenia jasminoidesandAstragalus membranaceuswere higher than 100.00 mg/mL.The results of joint bacteriostatic test showed that the fractional inhibitory concentration index(FICI)of the pairwise combination ofF.mume，R.coptidis，Te.chebulaandPo.cuspidatumwas lower than or equal to 1，and FICI ofC.fraxiniwithPo.cuspidatumandF.mumewas higher than 2.TheF.mume，R.coptidis，Te.chebula，Po.cuspidatum，C.fraxiniandS.officinalishad a good antimicrobial activity.The pairwise combination ofF.mume，R.coptidis，Te.chebulaandPo.cuspidatumshowed an enhanced or additive synergy action，andC.fraxinishowed antagonistic action withF.mumeandPo.cuspidatum，respectively.

Fructus mume;Rhizoma coptidis;Terminalia chebula;Polygonum cuspidatum;Actinobacillus pleuropneumoniae;antimicrobial activity

S852.6

A

1001-411X(2014)03-0013-05

2013-08-19 优先出版时间：2014-03-31

优先出版网址：http:∥www.cnki.net/kcms/doi/10.7671/j.issn.1001-411X.2014.03.003.html

康 帅(1989—)，男，硕士研究生，E-mail:kangshuaij@163.com;通信作者:殷中琼(1968—)，女，教授，博士，E-mail:yinzhongq@163.com

“十二五”农村领域国家科技计划项目(2011BAD34B03):四川省青年科技创新研究团队(2013TD0015)

康 帅，殷中琼，贾仁勇，等.乌梅等20种中药对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性研究［J］.华南农业大学学报，2014，35(3)：13-17.