RP-HPLC法测定人血清中万古霉素的浓度

福建医科大学附属漳州市医院药学部，福建 漳州 363000

RP-HPLC法测定人血清中万古霉素的浓度

陈宜锋李碧峰*黄小红冯惠平

福建医科大学附属漳州市医院药学部，福建 漳州 363000

目的建立血清中万古霉素浓度的反相高效液相色谱法的测定方法。方法以去甲万古霉素为内标，血清样品经10%高氯酸溶液沉淀，采用TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾(18∶82)为流动相，流速为1.0 ml·min-1，紫外检测波长为230 nm。结果在1.0～100.0 mg·L-1浓度范围内线性良好(r=0.999 89，n=7)，回收率高，日内、日间RSD均小于3%，理论塔板数大于6 000，最低检测限为0.12 mg·L-1。结论本法样品取样量少，处理方法简便，灵敏度高，方法准确稳定，回收率高，适用于临床常规血药浓度监测及相关科研的应用。

万古霉素；去甲万古霉素；血药浓度；高效液相色谱法

万古霉素(vancomycin，VAN)临床主要用于治疗革兰阳性菌严重感染，也用于血液透析患者发生葡萄球菌属所致的动静脉分流感染，口服适用于甲硝唑无效的假膜性结肠炎或多重耐药葡萄球菌小肠结肠炎[1]。但高浓度的万古霉素可导致可逆性耳聋、耳鸣、听力损害及肾损害等不良反应，毒性较大，且万古霉素的耐药菌感染成为临床上非常棘手的问题，因此在临床应用过程中特别是存在肾功能损害或合并使用有肾功能损害的药物时，需要监测人体内的血药浓度。本实验摸索了高效液相色谱法测定人血清中万古霉素的浓度，可供临床日常监测使用。

1 仪器与试剂

Aglient HPLC 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；ChemStation A.10.OX化学工作站；WH-861旋涡混合器(太仓市科教器材厂)；TP-300型超声波清洗机(北京天鹏电子新技术有限公司)；SIGMA-3K15离心机(德国Sigma公司)；AE-240型电子分析天平(梅特勒托利多有限公司)；185个人型超纯水机(美国Millipore公司)；AE-320型pH计(梅特勒托利多有限公司)。

万古霉素、去甲万古霉素标准品均购自中国药品生物制品检定所；甲醇(色谱纯，美国Tedia公司)；超纯水(本实验室制备，即蒸馏水经Millipore纯水机去离子水)；血清(门诊健康体检者，由我院检验科提供)；其余试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为磷酸二氢钾缓冲液(0.05 mol·ml-1，pH=3.2)-甲醇(82∶18)(V/V)；流速为1.0 ml·min-1；检测波长为230 nm；柱温为33℃；进样量为20 μl。

2.2 溶液的配制 标准品的配制：精确称取万古霉素标准品50 mg于50 ml量瓶中，加水溶解至刻度，配成浓度为1 g/L的储备液；临用时精密量取万古霉素储备液1 g/L适量分别稀释成10.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、100 0.0 mg/L的溶液，置冰箱待用。

内标液的配制：精密称取去甲万古霉素标准品15 mg于25 ml量瓶中，加水溶解至刻度，配成浓度为0.6 g/L的溶液置冰箱待用。

2.3 血清样品的处理 往空白血清中加入内标液20 μl，再加入10%高氯酸溶液40 μl，漩涡充分混匀3 min，10 000 rpm，4℃离心10 min，取上清液130 μl，加入1 mol/L氢氧化钠溶液10 μl，漩涡充分混匀30 s后，取上清液20 μl进样。

2.4 色谱分离情况 空白血清、血清中加标准品、血清中加内标物、血清中加标准品和内标物，分别按上述样品处理方法进行处理，结果见下图1。由图可见，在上述实验条件下，血清内源性杂质对万古霉素、去甲万古霉素均无干扰，且万古霉素与内标去甲万古霉素能有效分离。

2.5 标准曲线的制备 取7根具塞试管中分别加入160 μl空白血清，每根试管中加入20 μl内标液，然后精密量取上述标准品溶液20 μl，依照顺序加入试管中，按上述色谱条件处理样品。以万古霉素的浓度X(C，mg·L-1)为横坐标，测得的万古霉素峰面积AV与内标液峰面积AN之比Y为纵坐标进行线性回归，得标准曲线方程为Y=0.016 014 22X-0.005 080 7(r=0.999 89，n=7)。表明万古霉素的血药浓度在1.0～100.0 mg·L-1范围内呈良好的线性关系，理论塔板数大于6 000。以大于基线3倍信噪比(S/N)为最低检测限，得出万古霉素浓度最低检测限为0.12 mg·L-1。

2.6 回收率试验 分别精密吸取标准液适量，加入160μl空白血清中，配成浓度分别为10.0、40.0、80.0 mg·L-1的溶液各5份，按上述色谱条件处理，以标准曲线计算出万古霉素的血药浓度，以测得值与加入值之比计算回收率。结果低、中、高浓度的方法回收率分别为100.3%、99.8%、100.2%，平均回收率为100.1%。

表1 日内精密度和日间精密度

2.7 精密度的测定 取低、中、高三种浓度的标准液，分别配成浓度为10.0、40.0、80.0 mg·L-1的溶液各5份，按上述色谱条件处理，以标准曲线计算出万古霉素的血药浓度，每种浓度1天内测定5次，测得的万古霉素浓度计算日内精密度；同法操作以1周内3个样品每种浓度连续5天测得的万古霉素浓度计算日间精密度。结果低、中、高3种浓度的日内RSD分别为1.60%、0.71%和0.65%，日间RSD分别为2.92%、1.19%和0.62%，均小于3%。记录如表1。

2.8 稳定性试验 取万古霉素对照品溶液(40mg·L-1)20 μl按“2.6”项下操作，分别在0、6、12、24、48、72 h(除0 h外均行冷冻后再融处理)进样测定，记录峰面积。结果，峰面积的RSD=1.46%，表明对照品溶液在72 h内基本稳定。

2.9 样品测定 取临床血清样品5份，按“2.3”项下操作，测定万古霉素血药浓度分别为8.12、12.23、18.44、24.71、16.80 mg·L-1。万古霉素及内标物出峰时间快、患者血清内源性杂质影响较小，为临床及时提供了调整给药方案的依据。

3 讨论

3.1 血清浓度与血浆浓度 有报道[2-4]考虑到只有游离型药物才能运到作用部位产生药理效应，通常也仅是其与药理作用强度密切相关，大部分存在于血清中；结合型药物相对分子质量增大，不能跨膜转运、代谢或排泄，暂时失去药理作用而储存在血液中。因此，笔者采用了测定药物的血清浓度。

3.2 内标物的选择 关于内标物的选择，一般选择结构相近的物质。有报道[5]采用维生素B12作为内标，梯度洗脱后使维生素B12出峰提前，但其程序复杂，因此未用维生素B12作为内标液；还有文献[4]指出用替硝唑作为内标，但是不能排除临床应用过程中由于患者同时感染厌氧菌而合并使用替硝唑而影响内标物定量的情况。而去甲万古霉素不仅结构与万古霉素相近，其作用机制、抗菌谱、排泄途径及适应症也均与万古霉素相似，且两者不会同时使用，因此采用去甲万古霉素作为内标物。

3.3 蛋白沉淀剂的选择 目前报道使用的蛋白沉淀剂有甲醇[4]、乙腈-异丙醇[3]、乙腈-二氯甲烷[6]、固相萃取[7]、三氯醋酸[8]或硫酸锌[2]等。由于万古霉素不溶于甲醇、乙腈等有机溶剂，固相萃取成本太高，三氯醋酸不稳定需现用现配等原因，笔者初筛选出硫酸锌和高氯酸作为蛋白沉淀剂来对比试验研究。试验中发现用20%硫酸锌沉淀血清高速离心(10 000 rpm)后取出上清液不久，又再次出现浑浊现象，增加离心转速(14 000 rpm)及延长离心时间(20 min)后发现上述现象仍然如此。经过反复验证，使用硫酸锌沉淀都不能获得满意效果。笔者认为可能由于硫酸锌沉淀蛋白是可逆性的，取出上清液时硫酸锌的浓度发生了变化，离心后放置一段时间，硫酸锌复溶导致溶液浑浊影响进样。而高氯酸沉淀蛋白的过程是不可逆过程，可以使血清蛋白沉淀完全。但考虑到高氯酸是强酸，对色谱柱寿命有影响，所以最后加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液10 μl中和酸性以保护色谱柱。

此外，pH值对研究影响较大，过酸保留时间延长，过碱保留时间缩短，且均会使峰面积降低，因此正确调节pH值至关重要。通过试验摸索最终确定33℃甲醇:磷酸二氢钾(18:82，pH=3.2)时万古霉素、去甲万古霉素的保留时间较合适且血清等内源性杂质无干扰，峰形较好，基线稳定，准确度及灵敏度高，重现性好。该方法样品取样量少，处理方法简便，适用于临床常规血药浓度监测及相关科研的应用。

[1]卫生部合理用药专家委员会组织编写.中国医师药师临床用药指南2010年版[M].重庆：重庆出版社，2009：157.

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DeterminationofVancomycininHumanSerumbyRP-HPLC

CHEN Yi-feng,LI Bi-feng,HUANG Xiao-hong,FENG Hui-ping

Department of Pharmacy,，Zhangzhou Municipal Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Zhangzhou 363000，China

ObjectiveTo develop a method for the determination of vancomycin concentration in human serum by high-performance liquid chromatography(HPLC).MethodNorvancomycin was used as internal standard and the sample deposited by 10% perchloric acid was separated on TC-C18 analysis column(250 mm×4.6 mm, 5 μm) with a mobile phase of mixture of methanol:0.05mol·L-1potassium dihydrogen phosphate(18∶82). The flow rate was 1ml/min, the UV detector wavelength was set up 230 nm.ResultThe calibrated linear plot of vancomycin was within 1.0～100.0 mg/L(r=0.999 89,n=7), the average recoveries in serum were high, intra-day RSD and inter-day RSD were both less than 3%, the theoretical plate number were more than 6 000,the limit of test was 0.12 mg·L-1.ConclusionThe method is accurate, simple, sensitive and suitable for the study of therapeutic drug monitoring for vancomycin in human serum in clinic and other fields.

vancomycin;norvancomycin; serum drug concentration;HPLC

陈宜锋,主管药师，主要从事临床药学研究。E-mail： brantchan@hotmail.com

李碧峰,副主任药师，主要从事医院药学研究。E-mail：lbf.307@163.com

R284.1

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1007-8517(2014)11-0011-03

2014.04.07)