藏药余甘子对大鼠CYP2C9活性的影响

青海大学医学院，青海 西宁 810016

藏药余甘子对大鼠CYP2C9活性的影响

段雅彬姚星辰李向阳*

青海大学医学院，青海 西宁 810016

目的分析藏药余甘子对CYP2C9酶活性的影响。方法对照组灌胃给予生理盐水，实验组灌胃给予余甘子。采用探针药物法评价CYP2C9的活性，探针药物以及代谢产物的浓度用HPLC测定。结果对照组和实验组大鼠CYP2C9活性分别为0.083±0.042和0.100±0.049 ，两组数据差异无统计学意义。结论余甘子对大鼠CYP2C9的活性无影响。

藏药；余甘子；CYP2C9

余甘子为大戟科叶下珠属植物，在《藏药标准》所载的290种藏药成药中，含余甘子的有 72 种，占总数的25%。余甘子有防癌作用、抗诱变、抗致畸、抗炎、抗氧化、抗衰老、保肝、 抗溃疡、免疫调节作用[1]。并且有清热凉血，消食健胃，生津止咳的功效[2]。CYP2C9是P450酶系第二亚家族中的一个重要成员，占肝微粒体P450蛋白总量的20%，约有16%的临床药物由CYP2C9负责代谢，如苯妥因，格列苯脲，双氯芬酸，氯沙坦等。但余甘子对其他复方制剂影响的研究尚未见报道，本文以CYP2C9为研究对象，用探针药物[3-5]来分析藏药余甘子对该酶活性影响，为藏药余甘子临床用药和配伍机制提供一定的参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 高效液相色谱仪(日本岛津)；N2000型色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所)；XW-80A旋涡混合器(上海精科有限公司)；TGL-16B高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；各种常规仪器等。

1.1.2 药品与试剂 余甘子(西宁中藏药材批发市场购买，经青海大学医学院魏全嘉教授鉴定)；苯妥英钠(东京化成工业株式会社，批号：GF01-FD)；4′-羟化苯妥英(Sigma公司，批号：00213DG)；乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，批号：T20090811)；甲醇、乙腈为色谱纯；水为纯净水；其余试剂均为分析纯

1.1.3 实验动物 Wistar大鼠20只，清洁级，雌雄各半，体质量(200±20)g，由兰州大学医学实验中心提供，合格证号为14-006。饲养温度(23±2)℃，照射时间12 h/d(7：00～19:00)，饲养一周后进行实验。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 将大鼠分为对照组、实验组共2组，每组10只，雌雄各半。对照组灌胃给予生理盐水(5 ml/kg)，连续3天。实验组灌胃给予余甘子提取液(5 ml/kg)，连续3天。第4天对照组和实验组灌胃给予探针药物苯妥英钠(15 mg/kg)。

1.2.2 余甘子提取液的制备 取干燥余甘子并精密称取100 g，加入水 1 000 ml浸泡30 min，加热至沸腾，回流50 min，过滤，蒸发浓缩，使其质量为0.4 g/ml。

1.2.3 对照品溶液配制 精密称取4′-羟基苯妥英5 mg，置5 ml 量瓶中，加入纯净水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得4′-羟基苯妥英贮备液(1 mg·ml-1) 。取此液0.5 ml置5 ml 量瓶中，加入纯净水定容，即得100 μg·ml-14′-羟基苯妥英水溶液；依次稀释成10、1 μg·ml-1的溶液。按相同方法配制得100、10、1 μg·ml-1的苯妥英钠水溶液。

1.2.4 样本采集 对照组和实验组给予苯妥英钠12小时后采集血液，分离血清，冰箱冷冻保存待测。

1.2.5 血浆样品处理 从冰箱中取出样品在室温下解冻，涡旋30秒，吸取120μl血清样品加40μl 30%HCLO混旋1 min，TGL-16B高速离心机 16 000 r/min离心10 min，取上清液10(l采用高效液相色谱进样分析。

1.2.6 酶活性评价 大鼠给予苯妥英钠后测定12 h血清中苯妥英钠(PHT)和代谢产物4′-羟基苯妥英(HPPH)，以HPPH/PHT的浓度比值评价CYP2C9的活性。

1.2.7 色谱条件 采用反相高校液相色谱法测定血清中苯妥英钠和代谢产物的浓度。色谱条件 PHT和HPPH：流动相为乙腈-水-冰乙酸-三乙胺 (40∶60∶0.3∶0.3, v/v)，色谱柱为Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm，5(m)，流速为1.0 ml·min-1，检测波长为220 nm；进样量10μl。在此条件下将一定浓度的苯妥英钠和4′-羟基苯妥英的对照品溶液进样10μl，得对照品溶液色谱图(Figure 1 A)；取大鼠空白血清，按样品处理项下方法操作，进样10μl，得空白血清色谱图(见Figure 1 B)；将一定浓度的苯妥英钠和4′-羟基苯妥英的对照品溶液加入空白血清中，依同法操作，得相应色谱图(Figure 1 C)；取给药12 h后的血清样品，依同法操作，得给药后的色谱图(Figure 1 D)；其中苯妥英钠和4′-羟基苯妥英的峰形良好，基线平稳；结果表明，血清中的内源性物质不干扰苯妥英钠和4′-羟基苯妥英的测定。

1.2.8 回收率及精密度 配制低、中、高浓度的标准血清样品 (苯妥英钠和4′-羟基苯妥英均为1、6、20 μg/ml)按“样品预处理”项下操作并进样分析，测定值与相同浓度对照品溶液测定值相比计算回收率(n=5)；同日和连续5 日各处理5 份样品, 求日内RSD和日间RSD。精密度与回收率结果分别见表1。

表1 精密度及回收率考察结果(n=5)

1.2.9 数据处理 所有数据以mean±SD表示，SPSS13.0统计软件进行分析处理,采用两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

采用前述建立的HPLC法测定对照组与实验组给药后的CYP2C9酶活性，对照组与实验组给药后的CYP2C9酶活性评价。由表2可知，对照组与实验组大鼠CYP2C9的活性无统计学意义，余甘子对CYP2C9的活性无影响。

表2 对照组与实验组CYP2C9酶活性

3 讨论

基于P450的中药配伍机制研究文献报道较多，刘琳娜[6]等验证了甘草水煎液对P450活性有一定增强作用；呼自顺[7]等研究表明黄芩对CYP2C9的活性有增强作用，说明黄芩对其他药物的代谢起到减毒防毒的作用。本文研究显示余甘子虽对CYP2C9活性无影响，但对其它P450各亚酶活性影响如何，哪类主要成分影响酶活性，当余甘子和酶诱导剂或酶抑制剂合用时又会产生何种结果，值得进一步研究。

叶亚琳[8]等通过采用CO还原差示光谱法测定CYP450的含量来说明对酶活性的影响，只能验证P450的活性，而探针药物法(苯妥英钠)可以特异性评价CYP2C9活性，李芹[9]等采用基因法研究P450酶活性，本研究采用探针药物法评价酶活性，并且比基因法要简便，快捷。本实验采用了Liehrospher C18色谱柱和乙腈-水-冰乙酸-三乙胺(40∶60∶0.3∶0.3，v/v)为流动相，进行等度洗脱，苯妥英钠和4′-羟基苯妥英可以在10 min中内完成测定，比文献报道[10]的分析时间明显缩短。

[1]侯开卫.余甘子化学成分及其在民族民间传统医药中的应用[J].中国民族民间医药杂志，2002，11(6)：345.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：142.

[3]李向阳，刘永年，袁明，等.高原低氧对药物代谢酶CYP2C9和2C19活性及蛋白表达的影响[J].药学学报，2012，47(2)：188-193.

[4]樊慧蓉，和凡，刘昌效.“Cocktail”探针药物法评价肝细胞色素P450酶同工酶影响的研究进展[J].中国药学杂志，2006，41(14)：1045-1048.

[5]扈金萍，闫淑莲，唐静成，等.Cocktail探针药物评价姜黄对肝细胞色素P450 酶的影响[J].首都医科大学学报，2004，25(4)：427-430.

[6]刘琳娜，王汝涛，王庆伟，等. 甘草水煎液对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶活性的影响[J].中国临床药理学与治疗学，2010，15(12)：1330-1333.

[7]呼自顺，王琤，张弋，等.Cocktail探针药物评价黄芩对大鼠CYP450活性的影响[J].中国医院药学杂志， 2010，30(2)：108-110.

[8]叶亚琳，张贞良，曹洋，等. 雷诺嗪对大鼠肝微粒体蛋白质及细胞色素P450的影响[J].广东药学院学报，2007，23(1)：53-55.

[9]李芹，王睿，许力，等.基因芯片法测定中国人群细胞色素P4502D6的基因多态性[J].中国临床康复，2006，10(24)：39-41.

[10]马春来，焦正，应寅清，等.反相高效液相色谱法同时测定人血浆中苯妥英钠、苯妥英钠及其主要代谢产物4′-羟苯妥英的浓度[J].中国药学杂志，2008，43(22)：1743.

TheeffectofTibetanmedicinephyllanthusemblicaontheactivityofCYP2C9

Duan Ya-bin YAO Xing-chen LI Xiang-yang

Medical College of Qinghai university,Xining 810016,China

ObjectiveTo analysis the effect of Tibetan medicine Phyllanthus emblica on the activity of CYP2C9.MethodsRats in control and experimental group were administrated orally saline and Phyllanthus emblica,respectively.The activity of CYP2C9 was evaluated by the probe drugs method,And probe drugs and metabolites concentration determined by HPLC.ResultsThe rats CYP2C9 activity in control group and experimental group were 0.083±0.042 and 0.100±0.049,respectively.There was no significant difference between two groups.Conclusionthe Phyllanthus emblica had no significant effect on the activity of CYP2C9 in rats.

Tibetan medicine；Phyllanthus emblica L；CYP2C9

青海省自然科学基金(2014-Z-909)。

段雅彬(1990-)，男，在读硕士研究生。

李向阳，Email：qhmclxy@163．com

R29

A

1007-8517(2014)11-0008-03

2014.04.03)