不同居群款冬种质资源SRAP遗传多样性分析

贺润丽，平莉莉，王伦宇，杨 静，郭慧青

（山西中医学院，山西太原030024）

款冬花为常用中药，是菊科款冬属植物款冬（Tussilago farfara L.）的干燥花蕾，又名看灯花、西冬花、九九花等，味辛、甘，性温，具润肺下气、止咳化痰之功效，可用于治疗急、慢性支气管炎及肺结核、咳嗽、咳吐脓血等症[1]。现代药理研究表明，款冬花有明显的止咳、袪痰、平喘、升压和抗炎等作用[1]。国内外已对款冬花的活性成分、药理作用、栽培等方面进行了大量的研究报道[2-9]，但有关从分子水平上研究款冬资源的遗传多样性目前尚未见报道。

随着临床用药的增大和自然环境的恶化，款冬野生资源日益枯竭，目前市场上销售的款冬花药材以栽培品为主，且主产于甘肃、陕西、山西、四川等地[2-3，9]。款冬花栽培以根茎进行无性繁殖，品质逐年下降，由于对其遗传背景、亲缘关系缺乏深入系统的研究，致使育种工作受到很大限制，急需从分子水平上研究我国款冬资源的遗传多样性。

本研究利用SRAP技术，对16个来自于不同地区野生和栽培的款冬种质资源进行分析，旨在从分子水平探讨款冬的遗传差异，为可持续利用和保护种质资源、选育优质高产的品种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

于2012年10—11月款冬花蕾采收期采样，采集到山西省11个县区的野生居群11份以及甘肃、河北、内蒙古的野生和栽培居群5份，共计16份种质资源，将采集的材料洁净后硅胶快速干燥叶片带回实验室，各居群的采集信息列于表1。供试材料均由山西中医学院裴香萍副教授鉴定，为菊科款冬属植物款冬（Tussilago farfara L.）。

表1 样品编号及来源

1.2 试验仪器和试剂

1.2.1 仪器 1-14型台式离心机（北京赛多利斯仪器系统有限公司），3K30恒温水浴锅（上海申腾生物技术有限公司），BIOPHOMETER核酸测定仪（EPPENDORF，德国），PTC-200 PCR仪（M.J.RESEARCH，USA），DYY-Ⅲ5电泳仪和 DYCZ-30C电泳槽（北京市六一仪器厂），BIO-RAD凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2.2 试剂 丙烯酰胺、双丙烯酰胺、37%甲醛、TEMED、硝酸银、β-巯基乙醇、琼脂糖、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）、Taq 酶、DNA Marker及 dNTPs等，均购自TaKaRa公司；SRAP引物于上海生工生物工程有限公司合成；NaCl，KAc等试剂为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 每个居群取20个单株的叶片等量混合，采用改进的CTAB提取法[10]提取叶片总DNA，存放于-20℃冰箱备用。

1.3.2 引物设计与筛选 参照Li等[11]发表的引物，设计了9个上游引物（ME1～ME9）和11个下游引物（EM1～EM11），如表2所示。

1.3.3 SRAP反应及电泳分析检测 SRAP-PCR反应体系为20μL，包括模板DNA 100 ng，10×PCR buffer 2.0μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.6μL，10μmol/L上、下游引物各1.0μL，Taq DNA聚合酶1 U，用超纯水补足至20μL。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸1 min，5个循环；94℃变性 1 min，50℃复性 1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物加入6.0μL 6×loadingbuffer，8%非变性丙烯酰胺凝胶检测，电泳缓冲液为1×TBE，稳压200 V，电泳至二甲苯青到凝胶底部时结束。采用硝酸银染色观察结果，染色后扫描仪扫描、记录。

表 2 SRAP 引物序列（5′→ 3′）

1.4 数据统计

根据扩增产物电泳图谱，仅统计100～2 000 bp之间有差异、易于识别的多态性条带，在相同迁移位置有条带的记为1，无条带的记为0，形成0，1矩阵，建立数据表格。

利用NTsys 2.10e分析软件、SM法计算遗传相似系数（GS），对结果以非加权算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，构建聚类树状图。

2 结果与分析

2.1 居群的多态性条带比率分析

表3 筛选的多态性引物及扩增结果

从表3可以看出，从99对引物中筛选出扩增产物条带信号强、重复性好、特征性好的11对引物。用11对引物组合对1个居群的款冬材料进行扩增，得到121条DNA条带，其中，多态性条带79条，多态性比率为65.3%，平均产生多态性条带7.2条，多态性比率在36.4%～100%之间。其中，引物组合ME9-EM5的SRAP扩增反应图谱如图1所示。

2.2 不同居群的遗传相似系数与聚类结果分析

根据11对引物组合的SRAP扩增数据，用NTsys 2.10e软件计算各个种质资源的遗传相似系数，结果（表4）表明，不同居群款冬样品间的相似系数变化范围为0.342～0.810，均值为0.587，表明供试材料多态性高、遗传变异丰富。其中，山西广灵款冬野生居群和河北蔚县栽培居群的相似系数最高，为0.810，表明二者亲缘关系最近；而山西广灵野生居群和甘肃天水秦州栽培居群的相似系数最小，为0.342，表明二者亲缘关系最远。

表4 16个居群的遗传相似系数

由图2可知，以遗传相似系数0.614为阈值，将各居群款冬分成五大类群，第Ⅰ类群以山西广灵野生居群和河北蔚县栽培居群聚在一起后，与内蒙古兴和的栽培居群、娄烦的野生居群聚在一起；第Ⅱ类群以山西兴县的野生居群单独成为一支；第Ⅲ类群包含了山西宁武、临县、太原天龙山、榆社、和顺、中阳、沁源7个野生居群，其中又可分为4个小分支；第Ⅳ类群以甘肃甘谷的野生居群单独成为一支；第Ⅴ类群以甘肃天水秦州区和陇西的栽培居群与山西夏县的野生居群聚在一起。

3 讨论

SRAP引物具有通用性，无需知道基因组信息，正反向引物两两搭配，降低引物合成成本[12-15]。本研究采用SRAP标记技术对不同居群款冬的遗传基础进行分析，显示了一定的优越性和可行性，且扩增条带较多，易辨别，重复性好，操作简单。

用筛选到的11对SRAP引物对16个野生和栽培款冬居群的基因组DNA进行扩增，得到清晰条带121条，其中，多态性条带79条，多态性比率为65.3%。统计结果显示，供试材料间的相似系数均值较小，说明所选材料遗传多样性较高，各居群款冬之间存在一定的遗传差异。

聚类分析表明，16个居群的款冬可分为五大类群，各居群并不是按地理界限严格地聚在一起，但与地理分布和栽培历史有一定的相关性[16-17]，如山西广灵、河北蔚县、内蒙古兴和有栽培款冬的历史，虽然在广灵采集的是野生居群，但与内蒙古、河北的栽培居群聚在一起，甘肃陇西和天水的2个栽培居群也聚在一起，这可能与这些地区互相引种有关。因为栽培款冬依靠根茎进行无性繁殖，目前生产上尚无一定品种，主要依靠从野生款冬挖取根茎进行繁殖，或者各栽培地之间相互引进种根进行种植。山西兴县与甘肃甘谷的野生居群各单独聚为一分支，虽然从形态上看，二者比较相似，表现为花蕾浅红色，植株纤细，但由于地理位置相距较远，各单独聚为一支。山西的大部分野生款冬居群聚在一起，内部又分为4个小分支，说明山西野生款冬居群遗传基础变异丰富。

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