响应面曲线法优化超声辅助茶多酚提取工艺研究

陶阿丽，余大群

(安徽新华学院药学院，安徽 合肥 230088)

响应面方法 ( Response Surface Methodology，RSM )是利用合理的试验设计并通过实验得到的一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。 随着计算机技术的发展，它已成为精度高、应用广并具有实用价值的优化技术[1]。采用响应面法优化工艺过程主要涉及3步:试验设计——建立数学模型评估相关性——预测响应值考察模型的准确性[2]。

茶多酚( Tea Polyphenol，TP) 是茶叶中的有效成分，又名茶单宁、茶鞣质，茶多酚由约30 多种含酚基的物质组成，是茶叶中所含的多羟基酚类化合物的总称。现代医学研究发现，茶多酚抗氧化性能比维生素的抗氧化效价高1倍，而且无毒，因此是一种理想的食品天然抗氧化剂。茶多酚还具有抗癌治病、防衰老、抗辐射、消除人体自由基、降血糖、防治心血管疾病、抑菌抑酶、沉淀重金属等一系列特殊的药理功能[3-6]。

由于超声波辅助提取法操作简便、溶剂用量少，能够较大限度地保留提取组分的天然活性，利用其产生的空化、机械扰动等物理作用的原理，粉碎植物细胞壁使目标物大量的浸出，故本研究采用超声波技术辅助来提取茶多酚。同时，采用Design-Expert 7.1.6软件对这几个因素进行响应面优化，以进一步确定优化工艺。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

试验所用茶叶采用绿茶黄山毛峰；试剂茶多酚纯品、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、乙酸乙酯、硫酸、氨水均为分析纯。

主要仪器有721E型紫外分光光度计、KQ118超声波清洗器、FA2004型电子天平、HH数显恒温水浴锅、SHZ-D循环水式真空泵、DHG-9023型电热恒温鼓风干燥箱、低速自动平衡离心机。

1.2 试验方法

1.2.1 茶叶的前处理

用研钵将茶叶碾碎，过60目筛备用。

1.2.2 超声法提取茶多酚的单因素试验

(1)提取时间对茶多酚提取率的影响 精密称取1.000g茶叶末于烧杯中，加入20ml沸水，分别采用超声提取10、20、30、40、50、60min，测定抽滤的滤液的光密度，计算茶多酚的提取率[7]。

(2)料液比对茶多酚提取率的影响 精密称取1.000g茶叶末于烧杯中，按照料液比(g/ml)1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35分别加入沸水，采用超声提取40min，测定抽滤的滤液的光密度，计算茶多酚的提取率。

(3)提取次数对茶多酚提取率的影响 精密称取1.000g茶叶末于烧杯中，加入30ml沸水，采用超声提取40min，按上述方法反复提取5次，测定抽滤的滤液的光密度，计算茶多酚的提取率。

1.2.3 响应面曲线优化试验

以茶多酚提取率为评价指标，通过单因素试验确定范围，应用Design-Expert 7.1.6软件，选取提取时间(A)、料液比(B)、提取次数(C)为考察因素，各因素设置3水平。根据响应面试验结果，确定茶多酚最佳提取工艺条件。

1.3 茶多酚的纯化

沉淀茶多酚：准确移取一定量茶多酚粗提液，在一定酸度条件下加入适量钙盐，离心分离，即得茶多酚-钙盐沉淀[8]。

沉淀转溶：向茶多酚钙盐沉淀物中加入一定量的硫酸溶液，搅拌，并在一定温度下放置，使之溶解。

乙酸乙酯萃取：将转溶后得到的清液，用适量的乙酸乙酯进行萃取可进一步纯化茶多酚。最后在60℃真空干燥即得茶多酚成品。

1.4 茶多酚含量测定

采用酒石酸亚铁比色法[9]测定茶多酚的含量,具体操作如下。

(1)按照文献[10]的方法配制茶多酚标准溶液、酒石酸亚铁溶液以及pH7.5磷酸盐缓冲液。

(2)分别精密移取茶多酚标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于25ml容量瓶中，加水4ml与5ml酒石酸亚铁溶液充分混合，再加入pH7.5的缓冲溶液至刻度，用1cm比色皿，在波长540nm处，以试液空白溶液做参比溶液，测定光密度。以茶多酚浓度为横坐标x，光密度为纵坐标y，绘制出标准曲线。

(3)准确称取茶多酚提取液1ml，注入25ml容量瓶中，加水4ml，与5ml酒石酸亚铁溶液充分混合，再加入pH7.5的缓冲溶液至刻度，用1cm比色皿，在波长540nm处，以试液空白溶液做参比溶液，测定光密度，根据标准曲线计算茶多酚的提取率。

1.5 加样回收率测定

精密移取茶多酚标准溶液1.0、2.0、3.0ml分别于9只25ml容量瓶中，各加入精密吸取的样品溶液1.0ml，按照标准曲线制备过程操作，在540nm波长处测光密度值，计算加样回收率。

2 结果与分析

2.1 茶多酚的标准曲线

图1 茶多酚标准曲线

茶多酚标准曲线见图1，其回归方程为y=8.1575x+0.0383(R2=0.9990)，可知茶多酚浓度与光密度呈良好线性关系。

2.2 提取时间对茶多酚提取率的影响

由图2可知，随着提取时间的增长，茶多酚的提取率发生先增后减的变化。在提取40min时茶多酚的提取率达到最高值，时间过长茶多酚提取率反而下降，可能是由于长时间超声提取导致茶多酚发生氧化所致[11]。

2.3 料液比对茶多酚提取率的影响

由图3可知，当料液比(g/ml)为1∶30时，茶多酚的提取率达到最高。

图2 不同提取时间下的茶多酚提取率图3 不同料液比下的茶多酚提取率

图4 不同提取次数下的茶多酚提取率

水平因素料液比/(g/ml)提取时间/min提取次数11∶2535121∶3040231∶35453

表2 响应面试验结果

2.4 提取次数对茶多酚提取率的影响

由图4可知，随着提取次数的增加，茶多酚的提取率先增后减。当提取次数为3次时，茶多酚的提取率达到峰值，因此最佳提取次数为3次。

2.5 茶多酚提取的最佳条件

根据单因素试验结果，选择提取条件为料液比(g/ml)1∶25、1∶30、1∶35，提取时间35、40、45min，提取次数1、2、3次，作为自变量设计响应面分析试验，以茶多酚提取率为响应值[12]，因素和水平取值如表1。

根据 Box-Behnken的中心组合设计原理[13]，设计了3因素 3水平共 17个实验点( 5个中心点，每个实验点重复 2 次) 的响应分析试验，试验结果见表2。

响应面分析方法的图形是特定的响应面对应的因素A、B、C构成的一个三维空间，可以直观反映各因素对响应值的影响，从试验所得的响应分析图上可以分析出它们之间的相互作用。从响应面分析图5、图6、图7中可以看出响应值与3个影响因素料液比、提取时间和提取次数的关系。

综合上述试验，采用Design-Expert 7.1.6软件对表2结果进行响应面回归分析，得拟合方程：

Y=18.98+0.82A+0.083B+3.70C-0.09AB-0.13AC+0.2BC-0.92A2-0.62B2-0.93C2，其中Y为提取率，A为料液比，B为提取时间，C为提取次数。回归方程显著性检验及方差分析结果见表3。

图5 料液比与提取时间响应图图6 料液比和提取次数响应图

图7 提取时间和提取次数响应图

由表3可知，模型P<0.05，回归方程具有显著性，由响应面分析法对茶多酚提取率的ANOVA分析结果可以得出，液料比(A)、提取次数(C)对茶多酚的提取率有显著影响，而提取时间(B)则无显著影响。对试验结果进一步分析得，最佳提取工艺条件为提取时间40.99min、料液比(g/ml)1∶31.84、提取次数为3次。在此条件下绿茶中茶多酚的提取率为21.91%。

2.6 加样回收率测定

将绿茶中提取液稀释后测定其光密度，并计算稀释后茶多酚的含量，结果见表4。

表3 响应面分析法对茶多酚提取率的ANOVA分析结果

表4 绿茶提取物中茶多酚的含量

以茶多酚纯品为标准,测定绿茶提取液中茶多酚的回收率，结果见表5。

加样回收率的RSD为0.59%，说明该工艺稳定，方法可靠[14]。

3 结论

本研究以水溶液做溶剂，超声辅助提取茶叶中的多酚类物质，在确定了最佳工艺条件后，根据单因素试验得出影响茶多酚提取率的各因素的范围，据此进行响应面分析试验，由响应面分析法对茶多酚提取率的ANOVA分析结果得出，料液比和提取次数的影响尤为显著，根据单因素试验以及响应面试验的结果，进一步确定了茶多酚提取的最佳工艺条件为:料液比(g/ml)为1∶31.84，提取时间 40.99min ，提取次数 3 次。

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