氮素形态对紫花苜蓿盛花期生长及结瘤固氮的影响

叶 芳，刘晓静，张进霞

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

氮素是植物体内蛋白质、核酸、叶绿素和一些激素等的重要组成部分，是构成作物生长和产量形成的首要因素[1-3]。氮肥对豆科植物根瘤菌侵染、根瘤发育、固氮等都有影响。氮素供应不足时会抑制根瘤的生长发育[4]，从而进一步抑制固氮酶活性和根瘤固氮。苜蓿作为家畜饲用的重要豆科牧草，可以借助根瘤中的共生固氮菌直接吸收空气中的分子态氮，但其固氮量远远不能满足苜蓿生长发育对氮的需求，还必须施用氮肥。适量施氮不仅可以促进苜蓿根的分枝，增加根长，提高根重，还能明显促进紫花苜蓿结瘤固氮、增加紫花苜蓿的鲜干草产量及营养品质[5-7]。因此，适量的施氮肥不仅对苜蓿有一定的增产效果[8，9]，而且对我国畜牧业的可持续发展具有重要意义。

NO3--N和NH4+-N是植物生长过程中主要的两种矿质氮源，对植物的生长和发育有着重要作用[10]。研究表明，NO3--N可以促进植物根系的长度生长以及表面积和密度的增加[11]，NH4+-N可以促进紫花苜蓿生物量积累和结瘤固氮[12]。与单一的NO3--N或NH4+-N比，将NO3--N和NH4+-N以适度比例混合施用可以促进绝大多数旱作作物生长。Duxbury等[13]报道，苜蓿枝条的高度、单株重量和枝条数均随NH4NO3施用量的增加而增加。Feil B等[14]研究表明，单一的施用NO3--N或NH4+-N均会引起水稻生物量积累的减少，同时供应两种形态氮素比供应单一形态氮素更能显著提高水稻的氮素利用率，促进植物生长。目前，有关氮素对紫花苜蓿影响的研究由来已久，而其对苜蓿生长和生理特性也均有影响，但为了进一步研究氮素形态对“甘农3号”紫花苜蓿盛花期生长及结瘤固氮的影响，试验采用砂培法，通过营养液控制氮素形态来对比研究不同外源氮素对“甘农3号”紫花苜蓿盛花期生长及结瘤固氮的影响，以期为紫花苜蓿合理的氮素供应提供理论依据和数据支撑。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试紫花苜蓿品种为“甘农3号”紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.3)，由甘肃农业大学草业学院提供。

1.2 试验方法

1.2.1 种子处理 选取大小均匀，颗粒饱满的紫花苜蓿种子，95%乙醇浸泡5 min后，0.1% HgCl2溶液灭菌3 min，无菌水冲洗5～6次，最后用无菌滤纸吸干，备用[15]。

1.2.2 营养液配置 Fahraeus无氮植物营养液Na2HPO4·12H2O 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，柠檬酸铁0.005 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KH2PO40.1 g，Gibson微量元素1 mL，H2O 1000 mL，pH6.5～7.0。Gibson微量元素液H3BO32.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，CuSO4·5H2O 0.08 g，MnSO4·4H2O 2.03 g，Na2MoO4·2H2O 1.26 g，H2O 1 000 mL[16]。

1.3 试验设计

选用直径16 cm、高20 cm的花盆，装入经自来水冲洗再用蒸馏水清洗并经过高温灭菌的粗砂10 kg。每盆播种100粒灭菌种子，播种14 d后进行间苗，每盆保苗50株，然后浇入营养液，置于塑料防雨棚。设3种氮素形态：NO3--N，NH4+-N和混合态氮(NO3--N和NH4+-N按1∶1混合)；根据前期试验结果[17]设3个氮素水平0、105、210 mg/L(以纯氮计，最高浓度为霍格兰营养液中氮素的浓度，低氮为其倍数)，共7个处理，分别以0、NO3--105、NO3--210、NH4+-105、NH4+-210、NO3-+ NH4+-105、NO3-+NH4+-210表示，每处理重复15次，共105个处理，完全随机排列。以Fahraeus无氮植物营养液为基本营养液，分别加入Ca(NO3)2和(NH4)2SO4配制所需氮素浓度，并调节pH为7，结合无氮营养液一同施入。

2013年4月25日播种，每日喷浇3次蒸馏水，每次100 mL，直至对生真叶完全展开；之后每周淋浇1次配制营养液，每次500 mL；每7 d用蒸馏水淋洗盆栽1次以防止砂培中盐分积累，而后浇入新配制营养液。紫花苜蓿生长至三片复叶时，每盆接种新培养的苜蓿根瘤菌液50 mL(中华根瘤菌Sinorhizobiummeliloti)。在盛花期测定紫花苜蓿株高，生物量，茎叶比，根瘤数，根瘤重，固氮酶活性和全氮含量。

1.4 测定方法

株高 用直尺直接测量，每个处理重复30次。

生物量 用滤纸吸干地上部和地下部水分，放入烘箱105 ℃下杀青15 min，65～75 ℃烘干至衡重，称其干重。每个处理重复6次。

茎叶比 以每个处理各取6株长势相当的单茎，进行茎叶分离，分别置入烘箱105 ℃下杀青15 min，65～75 ℃烘干至衡重，称其干重。茎和叶的干重之比即为茎叶比。

统计单株根瘤数，每处理取10株。

根瘤重 将每个单株上摘下的根瘤在电子天平上称其鲜重，每个处理重复10次。

固氮酶活性 采用乙炔还原法测定[18，19]。称取0.2 g的新鲜根瘤置于7 mL玻璃瓶中，加盖橡皮塞后，从中吸出0.7 mL空气，注入0.7 mL乙炔，室温下反应30 min，待机器稳定后，用微量注射器抽取混合气体25 μL注入气相色谱仪(GC)进样柱中，测定C2H2、C2H4峰值。然后在同样条件下用标准乙烯测定并绘制乙烯的标准曲线，由此计算根瘤样品的固氮酶活性。每个处理3次重复。测定仪器为GC-7890F气相色谱仪，柱温180 ℃，进样器150 ℃，FID检测器170 ℃。气体压力N2为0.3 mPa，H2为0.08 mPa，空气为0.15 mPa。C2H4水平[(μmol/(g·h)] =h·x(样品峰面积)×C(标准C2H4水平，μmol/mL)/ hs(标准C2H4峰面积)×24.9×t(C2H2反应时间，h)×m(瘤重，g)。

植株全氮含 量采用浓H2SO4-H2O2法测定[20]，每个处理重复3次。

1.5 数据处理

采用Excel 2003软件进行数据整理，并用SPSS 17.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 氮素形态对紫花苜蓿盛花期株高、地上生物量、地下生物量和茎叶比的影响

氮素形态对紫花苜蓿盛花期的株高、地上生物量和地下生物量均有显著的影响。在接种根瘤菌并且其他营养供应充分的条件下(表1)，不同氮素形态处理下紫花苜蓿的株高、地上和地下生物量均显著高于CK(P<0.05)，且随着氮素水平的增加呈现增大的变化趋势。但NH4+-N处理下紫花苜蓿的地上生物量却随着氮素水平的增加而减小。同一氮素水平下，紫花苜蓿的株高表现为：NO3--N和NH4+-N混合培养下最大，NO3--N培养下次之，NH4+-N培养下的最低，各氮素形态处理间差异显著(P<0.05)。

地上和地下生物量总体表现为NO3--N和NH4+-N混合培养下最大，NH4+-N培养下次之，NO3--N培养下的最低，各氮素形态处理间有显著差异(P<0.05)，氮素浓度为105 mg/L时，紫花苜蓿的地下生物量表现为NH4+-N>NO3--N+NH4+-N>NO3--N。当NO3--N+NH4+-N的浓度为210 mg/L时紫花苜蓿的株高、地上和地下生物量均取得最大值。

随着氮素水平的增加，紫花苜蓿的茎叶比呈现减小的变化趋势，在相同的氮素水平下，不同形态氮素处理下紫花苜蓿的茎叶比表现为NO3--N培养下最大，NH4+-N培养下次之，NO3--N和NH4+-N混合培养下的最低，且差异显著(P<0.05)。NO3--N+NH4+-N的浓度为210 mg/L时，紫花苜蓿的茎叶比最小，为0.750，此时苜蓿的营养成分最高。

表1 不同氮素形态下紫花苜蓿株高、地上生物量、地下生物量和茎叶比Table 1 Nitrogen forms of the plant height,aboveground biomass,underground biomass and stem/leaf ratio of alfalfa

注：同列不同小写字母表示数据间差异显著(P<0.05)，下同

2.2 不同氮素形态下紫花苜蓿盛花期根瘤数、根瘤重和固氮酶活性

不同氮素形态处理下紫花苜蓿盛花期的根瘤数、根瘤重和固氮酶活性均显著高于CK(P<0.05)，除混合态氮培养下的根瘤重外，紫花苜蓿的根瘤数、根瘤重和固氮酶活性均随着氮素水平的增加呈现增大的变化趋势(表2)。在相同的氮素水平下，不同氮素形态处理下紫花苜蓿的根瘤数和固氮酶活性均表现为：NO3--N和NH4+-N混合培养下最大，NH4+-N培养下次之，NO3--N培养下的最低，各氮素形态处理间差异显著(P<0.05)。氮素浓度不同，对紫花苜蓿根瘤重的影响不同，氮素浓度为105 mg/L时，紫花苜蓿的根瘤重表现为：NO3--N+NH4+-N>NH4+-N>NO3--N；氮素浓度为210 mg/L时，则表现为：NH4+-N>NO3--N+NH4+-N>NO3--N，各氮素形态处理间差异显著(P<0.05)。紫花苜蓿的根瘤数和固氮酶活性均在NO3--N+NH4+-N的浓度为210 mg/L时，取得最大值，但根瘤重在NO3--N+NH4+-N的浓度为105 mg/L时取得最大值，由此可见，在盛花期氮素浓度过高会抑制根瘤的生长。

表2 不同氮素形态下紫花苜蓿根瘤数、根瘤重和固氮酶活性Table 2 Nitrogen forms of root nodule number,root nodulation and nitrogenase activity of alfalfa

2.3 氮素形态对紫花苜蓿盛花期地上部和地下部全氮含量的影响

各氮素形态处理下紫花苜蓿地上和地下部全氮含量均显著高于CK(P<0.05)，且随着氮素水平的增加均呈现增大的变化趋势。同一氮素水平下，紫花苜蓿的地上和地下部全氮含量均表现为：NO3--N和NH4+-N混合培养下最大，NH4+-N培养下次之，NO3--N培养下的最低，各氮素形态处理间差异显著(P<0.05)。NO3--N+NH4+-N的浓度为210 mg/L时，紫花苜蓿的地上和地下部全氮含量最高，地上部全氮含量较NH4+-N、NO3--N分别增加了0.14%，0.66%，地下部全氮含量较NH4+-N、NO3--N分别增加了0.45%，0.81%，说明NO3--N和NH4+-N均能促进紫花苜蓿氮含量的积累，NH4+-N处理下全氮含量高于NO3--N，二者以一定的比例混合使用最能增加紫花苜蓿植株体内全氮含量。

图1 不同氮素形态下紫花苜蓿地上部和地下部全氮含量Fig.1 Effects of nitrogen forms on aboveground and underground nitrogen content of alfalfa

3 讨论与结论

施氮不仅能提高作物的生物产量[21]和种子产量，同时还能增加紫花苜蓿干物质和氮素积累量[22]，可以明显改善紫花苜蓿的品质[23]，且苜蓿枝条的高度、单株重量和枝条数均随NH4NO3施用量的增加而增加。有研究证明，NH4+-N可以使根系明显变短、加粗，促进侧根的形成，从而增强紫花苜蓿营养吸收，促进紫花苜蓿生物量的积累。但董守坤等[24]在大豆的研究上表明，NH4+-N和NO3--N的共同存在更有利于大豆的生长。试验表明，盛花期各处理下紫花苜蓿的株高和生物量均显著高于CK，且随着氮素水平的增加呈现增大的变化趋势，也说明施氮能够促进紫花苜蓿的生长。不同氮素形态处理下，紫花苜蓿的株高表现为NO3--N和NH4+-N混合培养下最大，NO3--N培养下次之，NH4+-N培养下最低；生物量为NO3--N和NH4+-N混合培养下最大，NH4+-N培养下次之，NO3--N培养下最低。说明与单一NO3--N或NH4+-N相比，混合态氮最能促进紫花苜蓿的生长。分析原因可能是NO3--N和NH4+-N同时存在于生长的介质中会相互影响彼此的吸收速率及吸收动力，NO3--N可以促进植物对NH4+-N的吸收[25]，与混合态氮相比，单纯供应NH4+-N往往会抑制K+和Ca2+的吸收，并带来氨害，抑制生长[26]；单用NO3--N，亦有不利之处，在还原过程中消耗能量较多，若在弱光条件下，NO3--N吸收有可能受抑制，造成氮素供应不足。Chen等[27]研究也认为，NO3--N和NH4+-N混合营养下植物生长更具优势。茎叶比是衡量苜蓿品质的重要指标，苜蓿叶蛋白含量非常丰富，茎叶比越小，叶片的比例越高，营养物质含量就越多，适口性就越强，牧草的品质也就越好。张杰等[28]在苜蓿的研究中得出施氮量越多，苜蓿的茎叶比越小。试验也发现，随着氮素水平的增加，紫花苜蓿盛花期的茎叶比呈现减小的趋势，不同形态氮素处理下紫花苜蓿的茎叶比表现为：NO3--N培养下最大，NH4+-N培养下次之，NO3--N和NH4+-N混合培养下最低。

氮和豆科植物根瘤固氮酶活性、数量、形态结构的关系已有报道[29]。根瘤固氮酶活性是衡量豆科植物固氮有效性的重要指标。试验发现，不同氮素形态处理下紫花苜蓿盛花期的根瘤数、根瘤重、固氮酶活性和全氮含量均高于CK，表现为NO3--N和NH4+-N混合培养下最大，NH4+-N培养下次之，NO3--N培养下的最低，说明适量的NO3--N和NH4+-N均能促进紫花苜蓿结瘤固氮，但二者以一定的比例混合效果更佳。原因可能是NO3--N和NH4+-N同时存在于生长介质中时，会表现出联合效应，促进紫花苜蓿结瘤固氮。

综上所述，NO3--N和NH4+-N均能促进紫花苜蓿盛花期生长和结瘤固氮，但二者混合使用效果最佳，当NO3--N+NH4+-N的浓度为210 mg/L时，紫花苜蓿生长最好。

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