干旱胁迫下甘肃野生草地早熟禾内源激素水平的动态变化

俞 玲,马晖玲

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃 兰州 730070)

当今世界，水资源的匮乏是一个普遍性的问题，尤其在西北地区显得更加突出。干旱胁迫是限制草坪草生长的最重要的环境因子之一[1]，不仅威胁其幼苗的生存,且对后期产量、越冬等都有一定影响[2,3]。因此,研究其抗旱性,对北方地区草坪的建植、植被恢复以及生态环境改善具有重要意义。

内源激素是植物体内重要的生长调节物质,与植物抗逆性有着密切的联系。逆境条件打破了植物体内激素产生和分配的平衡状况,导致代谢途径发生变化,使植物对逆境的适应性与抗性增强[4],很多学者研究发现，气孔是对植物激素变化最敏感的部位，并且认为脱落酸(ABA)[5]和细胞激动素(CTK)[6]的相互作用对气孔开闭产生影响进而增加其对干旱的适应性。Lu等[7]研究证明在干旱胁迫下,小麦叶片中ABA含量升高,并且抗旱品种积累的ABA较多。目前,对优良抗旱草坪草草地早熟禾的选育成为研究热点，有关干旱胁迫下草地早熟禾生理指标的变化报道的很多[8-10]，而对草地早熟禾内源激素的动态变化研究还较少。因此，以甘肃省野生草地早熟禾为材料，采用高效液相色谱法，就不同草地早熟禾材料在干旱胁迫下ABA，IAA和ZT 3种内源激素的动态变化进行分析，探讨草地早熟禾对干旱胁迫的响应机制，以期为草地早熟禾抗旱性的深入研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料和试验仪器

安定(AD)和西和(XH)野生草地早熟禾种子分别采自甘肃省定西市安定区、陇南市西和县。

试验采用Agilent 1100 Series液相色谱仪、旋转蒸发仪、VWD检测器、紫外分光光度计、0.22 μm有机系针头过滤器。ZT标样购自兰州中瑞实验耗材经营部国产分装产品；IAA和ABA标样购自兰州科迈实验耗材经营部国产分装产品；甲醇、石油醚为色谱纯；其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 试验在甘肃农业大学草业学院培养室进行，2013年4月5日将野生草地早熟禾成熟种子播于直径18 cm的花盆，种植基质为土壤、有机质、砂子按7∶2∶1组成。试验设置对照(CK)和成坪以后进行的干旱处理，即草地早熟禾充分灌水(即达到土壤最大持水量)后不再浇水，令其自然失水，干旱处理以土壤含水量占最大持水量的百分比分为5个梯度：无胁迫(CK，100%)，轻度胁迫(75%～85%)，中度胁迫(55%～65%)，重度胁迫(35%～45%)，严重胁迫(15%～25%)，每份材料3个重复，当土壤含水量在设定的梯度范围时，采取叶片进行测量，每天早上8∶30补充前一天失去的水分，使各处理在采样时达到设定的含水量。

1.2.2 样品处理及HPLC分析 称取新鲜叶片1 g，加入10 mL预冷的80%甲醇，液氮研磨至匀浆。密封置冰箱4 ℃，浸提24 h，5 000 r/min离心15 min，取上清液，残渣再加入5 mL 80%的冷甲醇溶液避光数小时，相同条件离心10 min，合并上清液，用旋转蒸发仪35 ℃蒸至原体积的1/2。经C18胶柱分离纯化后，氮气吹干，流动相定容至1 mL，经0.22 μm有机系针头过滤，取20 μL进行色谱分析。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：采用Eclipse XDB-C8柱(4.6 mm×150 mm,5 um)；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：20 μL；流动相按甲醇∶0.6%冰乙酸(45∶55)为基准前后变化进行摸索，柱温设置25 ℃和35 ℃两个温度，进行比较。最后以激素彻底分离，峰形好来选择出最佳的流动相和柱温。

1.2.4 数据分析 利用Excel进行数据整理，Spass 19.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相的选择 采用甲醇和水作为流动相时，3种激素分离不完全，且色谱图拖尾现象严重，峰形不好。冰乙酸可以抑制样品的电离、改善拖尾现象，因此，在流动相中加入0.6%冰乙酸。试验就流动相中甲醇和冰乙酸的体积比进行分析比较，结果表明，当甲醇与0.6%冰乙酸体积比>45∶55时，各激素能完全分开，但色谱峰分离度较小；当体积比<45∶55时，激素灵敏度下降、保留时间迅速增加，且易对色谱柱的填充物造成损害；当体积比为45∶55时，各个激素分离彻底、峰形好，无拖尾现象。故选择甲醇∶0.6%的冰乙酸为45∶55的流动相。

2.1.2 柱温的选择 柱温对不同激素色谱峰之间的分离有显著的影响。因此,设定25 ℃和35 ℃ 2个梯度，对不同柱温下IAA，ZT和ABA之间的分离效果进行了研究，试验表明在25 ℃柱温下分离效果最佳。

2.2 干旱胁迫下野生草地早熟禾叶片内源激素的动态变化

2.2.1 干旱胁迫下草地早熟禾叶片ZT含量变化 干旱胁迫促使草地早熟禾ZT含量显著下降，但变化幅度因种质材料的不同而不同。轻度(75%～85%)、中度(55%～65%)和重度胁迫(35%～45%)下，AD和XH叶片ZT含量较对照均显著下降。严重胁迫下(15%～25%)，AD和XH叶片ZT含量继续下降至最低，分别为62.28、63.42 ng/g。干旱胁迫使AD叶片ZT的含量下降幅度最大，与对照相比，下降了62.45%(图1)。

图1 草地早熟禾叶片ZT含量Fig.1 Changes of ZT in leaves of indigenous

2.2.2 干旱胁迫下草地早熟禾叶片IAA含量变化 干旱胁迫下，草地早熟禾叶片IAA含量变化趋势相同，均先上升后下降。轻度胁迫(75%～85%)促进IAA含量的增加，其增加幅度存在差异，XH叶片IAA含量达到峰值，为690.84 ng/g，但明显低于AD；中度胁迫(55%～65%)下，XH叶片IAA含量下降而AD叶片IAA含量继续上升至峰值，为796.36 ng/g。随着胁迫程度的继续加大，AD和XH叶片的IAA含量均下降。胁迫末期，IAA含量均降至最低，分别为374.40、310.94 ng/g(图2)。

2.2.3 干旱胁迫下草地早熟禾叶片ABA含量变化 干旱胁迫促进ABA含量的积累。轻度胁迫下(75%～85%)，ABA含量较对照显著增加；中度胁迫下(55%～65%)，ABA含量变化存在明显差异，其中，XH叶片ABA含量显著降低，而AD叶片ABA含量继续增加并且达到峰值为443.98 ng/g；重度胁迫下(35%～45%)，ABA含量均下降，其中，XH叶片ABA含量降至最低；严重胁迫下(15%～25%)，AD叶片ABA含量下降，而XH叶片ABA含量略微上升，但均显著高于对照，干旱胁迫使AD叶片ABA含量增加幅度最大，为73.95%(图3)。

图2 草地早熟禾叶片IAA含量Fig.2 Changes of IAA in leaves of indigenous bluegrass

2.2.4 干旱胁迫下草地早熟禾叶片ZT/ABA,ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA变化 干旱胁迫下， ZT/ABA和(ZT+IAA)/ABA总体呈下降趋势，ZT/IAA先下降后上升，但较对照显著下降(表1)。其中ZT/ABA下降幅度最大，在70.69%～77.94%；其次为(ZT+IAA)/ABA，下降幅度为64.85%～70.29%；下降幅度最小的是ZT/IAA，在20.00%～29.17%。

图3 草地早熟禾叶片ABA含量Fig.3 Changes of ABA in leaves of indigenous bluegrass

胁迫期间，ZT/ABA、ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA变化幅度因胁迫程度的不同而不同。其中轻度(75%～85%)和中度(55%～65%)胁迫下，三者下降幅度最大，显著低于对照。重度胁迫(35%～45%)下，(ZT+IAA)/ABA和ZT/ABA继续下降，和中度胁迫相比，均差异显著。严重胁迫下，(ZT+IAA)/ABA和ZT/ABA继续下降至最低，与重度相比，前者差异显著，后者无显著性差异。整个胁迫期间，AD叶片ZT/ABA、ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA下降幅度最大。

表1 草地早熟禾叶片ZT/ABA,ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABATable 1 Changes of ZT/ABA,ZT/IAA and (ZT+IAA)/ABA in leaves of indigenous bluegrass

3 讨论与结论

3.1 干旱胁迫对草地早熟禾叶片内源激素含量的影响

3.1.1 干旱胁迫对叶片ZT含量的影响 ZT是植物体内最常见的细胞分裂素,其促进细胞分裂、扩大，侧芽发育，还促进营养物质移动和延迟衰老[11]，与植物抗逆性密切相关。水分胁迫期间ZT含量的降低，有利于植物保持较高的水分，是一种保护性的生理反应[12]。胁迫期间叶片ZT含量降低，导致植株生长速率减慢,从而缓解了干旱造成的压力。抗旱能力越强，自身调节能力就越大，即水分胁迫下ZT的合成越少[4]。胁迫期间安定野生草地早熟禾叶片ZT含量下降最明显，胁迫末期ZT含量只有对照的37.55%，说明安定野生草地早熟禾对干旱的耐受性较强。

3.1.2 干旱胁迫对叶片IAA含量的影响 试验研究中水分胁迫初期，IAA含量呈上升趋势，表明轻度干旱不足以对草地早熟禾的生长构成威胁，此时植物仍在生长，随胁迫程度的继续增加，IAA含量下降，可能是因为重度胁迫下，IAA的合成部位受损，无法继续合成IAA，植物通过抑制自身的生长来抵御干旱，总体而言，干旱胁迫下IAA含量与对照相比显著下降，这与Wang等[13]的研究结果一致。然而，在茶树和棉花等[14-17]研究中，干旱胁迫促进了IAA的积累，有关水分状况和内源IAA水平之间的关系，迄今为止还有争议，其内在机制尚需深入研究[18]。

3.1.3 干旱胁迫对叶片ABA含量的影响 ABA作为一种信号传导因子，主要由根产生,能够促进休眠、抑制生长、还可以促进气孔关闭和促进根系水分吸收[18，19]。轻度和中度干旱胁迫下，ABA含量积累较多，说明其在逆境下对环境变化的潜在适应性较强，然而这种适应性是有限度的，随着胁迫程度的继续加重，这种自我保护的机制会遭到破坏，从而使ABA含量下降。总体分析，草地早熟禾叶片ABA含量，均随胁迫程度的增加，呈上升趋势，赵文魁等[19]研究也得到了相似的结论，ABA能够增加植物根部的水分吸收，促使叶片气孔开度受抑或关闭，水分蒸腾减少，最终植物的保水能力提高。

很多学者认为，品种的抗旱性与ABA的积累密切相关，抗旱性越强，ABA含量增加速度越快，积累能力越强[18,20]，干旱胁迫下，安定野生草地早熟禾叶片ABA含量增加幅度最大，比对照增加了73.95%，初步推测安定野生草地早熟禾抗旱性强于西和野生草地早熟禾，然而ABA的积累又会引起叶片脱落，加速植株衰老。因此,干旱胁迫下植物体内积累的ABA并不是越多越好，此次试验ABA含量在胁迫后期下降正好说明这一点。

3.1.4 干旱胁迫对草地早熟禾叶片ZT/ABA,ZT/IAA,(ZT+IAA)/ABA的影响 随着干旱胁迫强度的增加，安定和西和野生草地早熟禾叶片的ZT/ABA、ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA呈下降趋势，这3种激素相互抑制，相互促进，共同参与了代谢平衡，干旱胁迫期间，IAA，ZT和ABA的变化总是向着促进气孔关闭，减缓生长发育，维持细胞膨压的方向代谢，以便植物最优化地利用有限水分，这在很多研究中得到了证明[21，22]。安定野生草地早熟禾叶片的ZT/ABA，ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA下降幅度大于西和野生草地早熟禾，表明其应对干旱胁迫的能力强于后者。

参考文献:

[1] 邹琦.植物生理学实验指导[M].北京:中国农业出版社,2000.

[2] 黎裕.作物抗旱鉴定方法与指标[J].干旱地区农业研究,1993,11(1):91-98.

[3] 李智念,王光明,曾之文.植物干旱胁迫中的ABA研究[J].干旱地区农业研究,2003,21(2):99-104.

[4] 孙志勇,季孔庶.干旱胁迫对杂交鹅掌楸无性系叶片内源激素含量的影响[J].安徽农业科学,2010,38(31):17362-17364.

[5] Davies P J.Hormones as regulators of water balance[M]∥Davies S T.plant hormones and their role in plant growth and development.Martinus Nijhoff Pubilishers,1987：411-430.

[6] Luke H H,Freeman T E.Stimulation of transpiration by cytokinins [J].Nature,1968,217:873-874.

[7] Lu D B,Paulsen G M.Increasing stress resistance by in vitro selection for abscisic acid insensitively in wheat[J].Crop science,1989,29(4):939-943.

[8] 温洋,孙吉雄,王代军.干旱胁迫对冷地型草坪草生理特性影响的研究[J].草原与草坪,2005(1)：43-45.

[9] 段碧华,尹伟伦,韩宝平,等.模拟干旱胁迫下几种冷季型草坪草抗旱性比较研究[J].草原与草坪,2005(5):38-41.

[10] 李显利,米福贵,闫立军,等.草地早熟禾不同品种抗旱性的评价分析[J].草原与草坪,2010,30(3):43-46.

[11] 李源,王赞,刘贵波,等.干旱胁迫下胶质苜蓿内源激素及解剖结构的研究[J].华北农学报,2010,25(6):211-216.

[12] 潘根生,吴伯千,沈生荣,等.水分胁迫过程中茶树新稍内源激素水平的消长及其与耐旱性的关系[J].中国农业科学,1996,29(5):9-15.

[13] Wang C h R,Yang A F,Yin H Y.Influence of water stress on endogenous hormone concentrations and cell damage of maize seedlings[J].Integrative Plant Biology,2008,50:427-434.

[14] 潘根生,钱利生,吴伯千,等.茶树新梢生育的内源激素水平及其调控机理(第三报)干旱胁迫对茶树内源激素的影响[J].茶叶,2001,27(1):35-38.

[15] 李东晓,李存东,孙传范,等.干旱对棉花主茎叶片内源激素含量与平衡的影响[J].棉花学报,2010,22(3):231-235.

[16] 沈法富,喻树迅,范术丽,等.不同短季棉品种生育进程中主茎叶内源激素的变化动态[J].中国农业科学,2003,36(9):1014-1019.

[17] 田晓莉,杨培珠,何钟佩,等.棉花根冠关系的研究根系伤流液及叶片内源激素的变化[J].中国农业大学学报,1999,4(5):92-97.

[18] 何卫军,焦旭亮,张振文,等.不同干旱胁迫水平下赤霞珠和黑比诺幼苗内源激素水平比较[J].干旱地区农业研究,2008,26(3):142-145.

[19] 赵文魁,童建华,张雪芹，等.干旱胁迫下几种柑桔植物内源激素含量的变化规律[J].农业与技术,2007,27(4):55-59.

[20] 陈立松,刘星辉.水分胁迫对荔枝叶片内源激素含量的影响[J].热带作物学报,1999(9):31-35.

[21] Tawainga K.Tillage and rotation effects on soil physical characteristics [J].Agronomy Journal,2002,94:299-304.

[22] Monneveux P,Belhassen E.The diversity of drought adaptation in the wild[J].Plant Growth Regulation,1996,20:85-92.