发酵法生产乳酸的研究进展

黄国昌，熊大维，张 婷，邱小忠

(江西省科学院微生物研究所，330096，南昌)

发酵法生产乳酸的研究进展

黄国昌，熊大维，张 婷，邱小忠

(江西省科学院微生物研究所，330096，南昌)

综述了国内外关于发酵法生产乳酸的现状，介绍了乳酸生产菌株筛选、诱变和基因工程育种及乳酸的发酵工艺的研究进展，并展望了废弃物作为原料用于乳酸发酵的前景。

乳酸；发酵；工艺；提取

0 引言

自1780年瑞典化学家Scheele发现乳酸以来，乳酸及其衍生物在食品、医药、轻工、化工及农业等领域被广泛应用。近年来，随着乳酸在食品、饮料和化妆品行业的大量使用，以及作为原料在聚乳酸工业生产中需求量的增大，乳酸在全球的生产量已超越柠檬酸和乙酸，位居第1。本文对国内外关于发酵法生产乳酸的现状进行了综述，并介绍了乳酸高产菌株的选育和有关发酵工艺的研究进展，以期为乳酸发酵生产和研究提供参考。

1 乳酸的国内外生产现状

到2008年为止，全球乳酸的总生产能力约为65万t/a，年产量约为37万t，主要生产地区为美国、西欧、日本和中国等地(表1)，近90%的生产厂家采用发酵法进行生产。在今后几年内，随着生产成本的降低，聚乳酸市场的不断扩大，乳酸产品的年需求将达到200～300万t[1]。

据CCM(China Chemicals Market，中国化工市场)调查，聚乳酸的消耗量已经超过了食品和饮料产业，成为全球乳酸的主要市场。然而，在中国，食品和饮料一直是重要的消费领域，占中国总消费的75.28%。在日本，化妆品和食品添加剂乳酸的消费量，占到乳酸总消费量的86%。预计2011-2015年，北美、日本和欧洲的生物可降解塑料将以超过6%的年增长率增长；在欧洲，2015年用于工业的生物可降解塑料预计达到6 700 t[2]。

世界领先的乳酸生产企业包括Archer Daniels Midland、CSM NV、Purac、Galactic SA、 Musashino Chemical Laboratory、Ltd(株式会社武藏野化学研究所)、河南金丹乳酸有限公司、武藏野化学(中国)有限公司、安徽丰原生物化学股份有限公司，后三者占据了国内乳酸市场的90%，其中河南金丹乳酸有限公司具有年产8 万t乳酸及系列产品的生产能力，生产规模居世界第2位、亚洲第1位，其中DL-乳酸产量居世界首位，是国内最大的乳酸生产和出口创汇基地[3]，然而D-乳酸生产厂家仅有2～3家，且规模较小。

表1 2008年全球各地区乳酸的产量和消费量/万t·a-1

表2 2008年、2013年全球乳酸消费结构/万t

2 发酵法生产乳酸的研究进展

发酵法生产L-乳酸常用的微生物主要有乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)和根霉菌(Rhizopussp.)，而产光学纯D-乳酸的生产菌株主要分布在乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)和明串珠菌属(Leuconostoc)等4个菌属。有关发酵法生产乳酸的研究目前主要集中在以下方面。

2.1菌种选育

L-乳酸的传统发酵菌种主要为米根霉，国内外报道了不同的方法用于米根霉育种。表3列举了对米根霉进行诱变选育的主要方法及突变株发酵乳酸的情况。

由于细菌发酵具有更高的得率和转化率，细菌厌氧发酵可大规模降低能耗，减少乳酸的生产成本，因此细菌发酵L-乳酸逐渐成为国内外近年来研究的热点。

DNA重组技术由于能对目标基因精确的进行遗传学操作，改变菌种的代谢途径，增加目标产物的产量，减少副产物的产生，并且能将目标基因转移到营养要求简单的菌株中，从而简化发酵工艺。Skory[12]首次将米根霉的乳酸脱氢酶基因在酵母菌中表达，又通过提高乳酸脱氢酶活性来提高米根霉的产酸能力，发现带有较长基因片段的质粒明显比带较短基因片段质粒的产酸量高；ZHOU[13]等去除了大肠杆菌中的甲酸裂解酶(pyr-uvate formatelyase,pflB)、乙酸激酶(acetate kinase,ackA)、乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,adhE)和延胡索酸还原酶(fumarate reductase,frdBC)4个基因后，将乳酸片球菌中的L型乳酸脱氢酶替换大肠杆菌本身的D型乳酸脱氢酶，构建出转化率高、L-乳酸纯度高的大肠杆菌基因工程菌。Chang[14]等在突变了磷酸转乙酰化酶(phosphotransacetylase,pta)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenol-pyruvate carboxylase,ppc)后，也得到了乳酸的高产菌株；Nikkila[15]等采用ldhD (D-乳酸脱氢酶)基因缺失策略，通过同源重组的基因替换方法构建了2株稳定的德氏乳杆菌工程菌。其中一株通过ldhD基因的启动子缺失阻止ldhD基因转录，另一株用ldhL基因代替ldhD基因，发现2株构建菌株L-乳酸脱氢酶活性分别提高了53%和93%，且只生产L-乳酸，产量增加1倍，与野生型总产酸量相等；Porro[16]等将LDH基因导入缺失丙酮酸脱羧酶基因的乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyceslactis)PMI/CI中，重新构建了酵母菌的细胞代谢途径，由于缺乏丙酮酸脱羧酶基因，合成乙醇的代谢途径受阻，代谢途径流向乳酸合成，所得菌株产乳酸浓度为109 g/L，产率为0.9 g/(L·h)，转化率为1.19 mol乳酸/mol葡萄糖。选择酵母菌的优点是可在比细菌更低的pH环境中生产有机酸。另外，在酿酒酵母菌中，Saitoh[17]等通过替换丙酮酸脱羧酶基因，发酵得到122 g/L高光学纯度的L-乳酸。

表3 国内外用于米根霉诱变育种的主要方式及诱变株发酵情况

表4 国内外用于发酵产L-乳酸细菌诱变的主要方法及诱变株发酵乳酸的情况

由于人体只有代谢L-乳酸的L-乳酸脱氢酶，L-乳酸作为食品添加剂等被广泛使用，加之L-乳酸在聚乳酸工业合成中的应用，L-乳酸的高产菌选育及高效生产工艺已得到高度的发展与开发，而D-乳酸的研究则相对较少。D-乳酸作为一个重要的手性中间体，已被用于多种手性物质的合成。近年来高光学纯度的D-乳酸因为在提高聚乳酸材料性能方面的实际应用而得到了更多的关注。研究显示PLLA(聚L-乳酸)和PDLA(聚D-乳酸)以1:1比例形成的共混PLLA/PDLA复合物因为PLLA和PDLA链间强烈的相互作用，其熔点(Tm)可以达到220～230 ℃，比纯的PLLA或PDLA(170～180 ℃)高出约50 ℃。因此，D-乳酸生产菌的筛选和育种工作越来越被人们重视，表5所列为国内外对D-乳酸生产菌的选育情况。

2.2发酵方式

发酵方式不同会直接影响菌体生长，对提高产物积累造成影响，目前菌种发酵方式有菌种固定化发酵、液体深层游离发酵等。杨子培[22]等利用玉米淀粉以米根霉(Rhizopusoryzae)TL-527-9作为发酵菌种进行深层发酵，发现可产酸9.41 g/L，L-乳酸纯度达98%以上；Yin[23]等在气升式发酵罐内用米根霉发酵玉米淀粉直接生产L-乳酸，得到乳酸质量浓度为102 g/L，得率为85%。Goksungur[24]等用甲壳糖杂化海藻酸盐对干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)NRRLB-441进行固定化并用来发酵L-乳酸，发现游离细胞数量比单用海藻酸钙作为载体的减少了很多，同时乳酸产量也相应有大幅增加；Tay[25]等则用棉布固定米根霉进行发酵，乳酸的产率接近100%；Sun[26]等使用了一种利用聚氨酯泡沫作为固定化载体的自然吸附方法对米根霉进行固定，发酵得率提高了2倍；李娟[27]等利用聚乙烯醇固定化米根霉，在投糖15%的情况下，L-乳酸产量提高了20%，达106.48 g/L；宁尚勇[28]等综合固定床和膜反应器的优点，采用固定化细胞浸没式膜生物反应器技术实现乳酸的连续发酵，发酵液中乳酸最终浓度为73.1 g/L，为连续化生产奠定了基础。

表5 D-乳酸生产菌的选育方法及生产能力比较

2.3发酵工艺

随着发酵工艺的不断发展，传统的发酵工艺(如分批发酵工艺、连续发酵工艺、固定化细胞反应器工艺)越来越显示出其弊端，新型发酵工艺如原位分离技术(in situ product removal，ISPR)得到了更多的尝试。ISPR技术是利用一定装置让成熟发酵液流向后处理单元减少产物反馈抑制的同时，使菌体返回生物反应器内继续使用，并适时排除衰老的细胞的工艺，包括电渗析发酵工艺、萃取发酵工艺、膜循环反应器工艺等，对连续发酵生产的实现具有重要意义。

电渗析方法有许多优点：1)不用中和剂就可控制pH值；2)减轻产物抑制；3)浓缩产物；4)简化后提取工艺。但是微生物细胞会逐渐附着到阴离子膜上，导致膜电阻增大，电渗析效率下降。Nomura等对此进行了深入而全面的研究，发现固定化技术是解决这个问题的有效途径。另外他们将中空纤维超滤膜和电渗析串联使用，以避免细胞附着到离子交换膜上被杀死，取得了干细胞的重量增大，活性细胞数目增大，发酵周期缩短，间歇培养速度加快的理想效果；李学梅[29]等将电渗析发酵法应用于米根霉发酵生产L-乳酸。由于米根霉的菌丝发达，发酵好氧，采用海藻酸钙包埋法固定米根霉，在三相流化床生物反应器中发酵，既可防止菌丝堵塞电渗析器，造成膜污染，又可解决传统米根霉发酵中菌丝缠绕结团的问题。

萃取发酵是在发酵过程中利用有机溶剂连续萃取出发酵产物以消除产物抑制的耦合发酵技术。Kwon[30]等利用双水相(aqueous two phase)提取法进行乳酸发酵，将聚乙二醇(PEG)水溶液和羟基醚纤维素(HEC)水溶液加入发酵液中使乳酸和菌体分离。而HEC对德氏乳杆菌(L.delb-rueckii)的生长无影响，而且双水相提取与间歇发酵相比，生产量增大1.3倍，乳酸产量提高15%。Chen[31]推荐微孔中空纤维膜(microprous hollow fiber membrane,MHF)溶剂提取法，连续原位提取乳酸。陈敏[32]等在油醇和三辛胺混合溶剂为非常规介质的反应系统中，对德氏乳杆菌的乳酸萃取发酵条件进行了研究。

膜反应器发酵将发酵和分离过程相结合，使发酵过程中保持了细胞的高浓度，细胞可循环使用，乳酸从发酵罐中连续移走，一方面可以减少pH调节剂的使用，减小因pH变化对产酸的影响，另一方面可以减少产物抑制作用，提高产率。Danner[33]等设计了超滤膜生物反应器(MBR)单极电渗析箱(ED)，构成MBR-ED单元操作系统，对从堆肥中筛选出来能利用己糖和戊糖的嗜热脂肪芽孢杆菌BS119进行连续发酵生产乳酸的研究。

2.4原料的选择

乳酸发酵的原料除了传统的葡萄糖、玉米淀粉、大米等原料外，世界各国的学者和机构纷纷开始对非粮食作物、工农林业废弃物和生活垃圾等含糖原料进行乳酸发酵研究，既可以降低乳酸生产的成本，又能解决废弃物的处理和污染问题，如美国的Cargill Dow公司已成功地利用玉米渣为原料来生产L-乳酸，再将L-乳酸制成生物可降解的聚L-乳酸。现将国内外采用不同原料进行乳酸发酵的情况总结于表6。

工业废弃物的成分复杂，发酵乳酸容易产生多种副产物，增加了提取和精制的难度，另外，对于纤维素和半纤维素类的农林废弃物转化发酵乳酸虽有较多报道，也取得了一定进展，但仍难用于工业化生产。因此，近些年对纤维素的酶解、木糖转化乳酸及乳酸发酵工艺等方面的研究越来越引起人们的关注。

表6 不同原料发酵乳酸研究情况

3 展望

随着聚乳酸市场的不断扩大，未来几年内，国际市场对乳酸的需求将急剧增长，而我国生产的乳酸主要以食品级的D,L-乳酸为主，高品质的乳酸主要依赖进口，并且乳酸生产的成本较国外更高。因此，未来的研究应更加深入对乳酸生产和精制工艺的改进，包括高产高光学纯度乳酸菌的筛选，乳酸菌发酵代谢的研究，基因工程菌的构建等；在发酵工艺方面，应该更多考虑菌种固定化和发酵与提取耦合的工艺研究，降低生产成本，获得更高品质的乳酸。在面临粮食安全及全球减排压力的形势下，对非粮食生物质原料发酵乳酸的研究将会是近些年研究的热点。此外，D-乳酸对提高聚乳酸的热稳定性等方面具有重要作用，市场对D-乳酸的需求也会日显突出，而目前国内外对D-乳酸的研究大多都处于小试阶段，工业化生产D-乳酸的规模较小，D-乳酸的发酵因为营养要求比较复杂，仍有较多课题值得研究和探讨。

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AdvancesinFermentationMethodsforLacticAcidProduction

HUANG Guochang,XIONG Dawei,ZHANG Ting,QIU Xiaozhong

(Jiangxi Academy of Science.Institute of Microbiology,330096,Nanchang,PRC)

Advances in the technology of lactic acid fermentation was reviewed in this paper.The breeding, mutation and genetic engineering breeding of lactic acid strain,as well as the technologies of fermentation were introduced,and the outlook of fermentation with waste material was also proposed.

lactic acid;fermentation;technology;extraction

2014-07-07;

2014-08-06

黄国昌(1981-)，男，江西抚州人，硕士，目前主要从事有机酸发酵和食品添加剂方面的研究工作。

10.13990/j.issn1001-3679.2014.05.019

TQ921+.3

A

1001-3679(2014)05-0660-07