新安固本培元方对脾虚型溃疡性结肠炎大鼠细胞因子的影响

贺云周，董昌武，张晓军，李必泽

（安徽中医药大学，安徽合肥230038）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）又称非特异性溃疡性结肠炎，系原因不明的大肠黏膜的慢性炎症和溃疡性病变，临床以腹痛、腹泻、脓血便等为主要表现，病程长，复发率高，治疗比较棘手。随着生活方式及饮食结构的改变，在我国UC发病率有逐年上升的趋势，西医目前仍以氨基水杨酸（如柳氮磺胺吡啶等）和激素为主，并未获得突破性进展，且长期服用西药毒副作用比较大。近年研究认为，细胞因子在发病、发展及预后中的作用已得到公认，促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子之间的平衡失调起着关键性作用［1］。本实验模拟脾虚证的临床致病因素，探讨新安固本培元方对脾虚型UC大鼠细胞因子的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 选用清洁级Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重200 g~300 g，由安徽医科大学动物实验中心提供。

1.1.2 药品与试剂 新安固本培元方（人参6 g，黄芪 20 g，白术 15 g，茯苓 12 g，当归 10 g，白芍 12 g，麦冬 12 g，陈皮 12 g，黄柏 10 g，黄芩 12 g，甘草 6 g），购自安徽中医药大学第一附属医院门诊部，浓煎至1 g/mL，4℃冰箱保存备用，柳氮磺吡啶（SASP，上海福达制药有限公司，批号0411109），冰乙酸（山东博山化学试剂厂生产，批号 67678），IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α检测试剂盒（北京福瑞生物有限公司）。

1.1.3 实验仪器 离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司，TGI6-II），电热恒温水箱（浙江省余姚市检测仪表厂，浙制02810715），酶联免疫检测仪（美国热电芬兰雷勃酶标仪，型号MK3），全自动γ放射免疫计数器（西安核仪器厂生产，型号FJ-2003/2008PS）。

1.2 实验方法

60只大鼠先分笼饲养并喂以一般饲料1 w，排除饲食异常者。随机分为空白对照组、模型组、柳氮磺吡啶组（SASP组）、固本培元方低、中、高剂量组6组，每组10只，雌雄各半。从实验第1天开始，除空白组予以普通饲料外，动物分笼饲养，自由饮水。模型组按参考文献［1-2］方法造模：番泻叶由安徽中医药大学第一附属医院门诊部中药房提供，用开水浸泡24 h，制成20%浸剂。20%番泻叶浸剂按每100 g体重1.5 mL灌胃，1次/d，灌服3 d后，禁食不禁水36 h，用戊巴比妥钠25 mg/kg腹腔注射麻醉，5 g/L肥皂水灌肠；20 min后肛门注入2 mL浓度为50 mL/冰乙酸的液体，动物苏醒后正常喂养，次日起继续灌服番泻叶2 d。自造模第3天开始，低、中、高剂量组按成人用量的 5，10，20 倍计算，即含生药量 4.6 g/kg，9.2 g/kg，18.3 g/kg，药物用蒸馏水配成 4.6 g/L，9.2 g/L，18.3 g/L。分别给予不同用药组相应的药物治疗，每只3 mL/d，模型组灌服等容积的蒸馏水，连续灌服7 d。阳性对照组（柳氮磺胺吡啶组）予以400 mg/kg柳氮磺吡啶溶于0.9%NaCl溶液2 mL中灌胃，连续7 d。

1.3 观察指标

1.3.1 大鼠症状、体征 每天记录实验大鼠的一般情况和脾虚症状，包括饮食、粪、尿、体质量、皮毛、活动情况、精神状态等。

1.3.2 病理改变 各组动物采血后脱颈椎处死，取距肛门约8 cm长末端的结肠，沿纵轴剪开，冷生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，平铺于冰块上。根据文献［3］的方法，进行大体形态损伤评分，后用甲醛固定，石蜡包埋、切片（4 μm），以备HE染色观察组织学改变。

1.3.3 血清IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α 的浓度测定末次灌胃后次日禁食不禁水12 h，造模7 d后，麻醉大鼠，称重，从心脏采血4 mL，置干燥无菌试管中，室温静置自然凝固收缩后，于37℃水浴中孵育20 min。以4000 r/min离心10 min，分离血清，保存于-20℃冰箱，以备检测血清TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠症状、体征比较

空白组大鼠强壮活跃，饮食正常，反应灵敏，喜打斗，活动正常，皮毛顺滑光泽，大便呈椭圆球状，体重逐渐增加。模型组自灌服番泻叶第2至3天，各大鼠即出现不同程度的腹泻，大便呈糊状或半糊状，肛门周围皮毛污秽，饮水量增多，饮食量略减少，嗜睡懒动。肛门灌入冰乙酸的第2天，各模型组大鼠饮食量明显减少，竖毛，易脱毛，有的出现腹胀。雄性大鼠阴囊下垂，出现黏液脓血便，消瘦，眯眼，神态极度萎靡等症状，自发活动明显减少。阳性对照组灌服柳氮磺吡啶后，腹泻及脓血便的次数逐渐好转，部分大鼠脓血便消失，饮食量及神态也渐好转，摄水量明显降低，至灌服柳氮磺吡啶第5天，有2只大鼠因脱肛脱水而死亡。高、中、低剂量组自灌服新安固本培元方后，体重、饮食及神态明显恢复，治疗1 w后各症状基本消失，恢复较柳氮磺吡啶组快。高剂量组在灌服中药后第2天，便溏即有不同程度改善，小便量明显增多，自发活动次数明显增多。

2.2 各组大鼠结肠黏膜病理变化比较

肉眼观察发现，空白组大鼠结肠黏膜皱襞纹理清晰，色泽淡红，未见溃疡面。模型组大鼠结肠黏膜充血、水肿，有溃疡形成，溃疡呈灶状或条状。SASP组大鼠结肠黏膜轻度水肿，有少数散在未完全愈合的溃疡灶。高、中剂量组结肠黏膜形态完全正常，溃疡面基本愈合。低剂量组结肠黏膜仅呈现轻度充血、水肿，溃疡面已愈合。

2.3 各组大鼠结肠黏膜形态损伤评分、血清IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α的浓度的比较

与空白组比较，模型组大鼠血清IL-6、IL-8及TNF-α的浓度及结肠黏膜形态损伤评分明显升高，IL-10含量显著降低（P<0.01）；与模型组比较，SASP组、高、中、低剂量组血清IL-6、IL-8及TNF-α的浓度及结肠黏膜形态损伤评分均明显下降，IL-10水平显著升高（P<0.01），且高剂量组降低TNF-α、减轻结肠黏膜损伤的效果优于中、低剂量组（P<0.05）。结果见表1。

3 讨论

中医文献无溃疡性结肠炎名称，根据其临床特点当属中医“泄泻”“痢疾”“便血”“肠风”等范畴。中医药依据整体理论，对本病进行辨证论治，并采用内、外结合的多种方法加以治疗，起到调节机体免疫、消除炎症、改善微循环、促进溃疡愈合的作用，具有较好的疗效。中医基础理论认为，“脾主运化”、“泄泻属脾”、“泄泻之本无不由脾胃”等。文献报道本病的病例中，中医辨证属脾虚型占大多数，其临床表现如纳差、腹胀、神疲乏力、腹痛喜按、肠鸣、面色萎黄、舌淡胖有齿痕、脉缓弱等与中医脾虚泄泻相近，可见本病证型以脾虚居多［1］。加之现代人们生活节奏加快，心理压力越来越大，生活水平的提高使膏粱厚味成为诱发UC的重要因素，饮食中各种添加剂甚至农药超标，都会在不同程度上影响脾胃的生理功能，进一步造成脾胃的病理改变，使脾胃亏虚，饮食水谷不及运化，而生湿、热、瘀、毒，因此脾虚是UC病程发生发展中的基本病机。

表1 各组大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α的浓度结肠黏膜形态损伤评分 （±s）

表1 各组大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α的浓度结肠黏膜形态损伤评分 （±s）

注：与空白组比较，1）P<0.01；与模型组比较，2）P<0.01；与高剂量组比较，3）P<0.05

组别 n IL-6（ng/L） IL-8（ng/L） IL-10（ng/L） TNF-α（ng/L） 结肠黏膜形态损伤评分（分）空白组 1025.31±2.0435.25±2.970.89±0.230.79±0.210.62±0.36模型组 1039.67±4.781） 49.32±5.291） 0.64±0.111） 1.79±0.171） 4.78±6.021）SASP 组 832.12±2.012） 40.17±2.212） 0.78±0.412） 1.39±0.192） 3.25±0.452）高剂量组 1026.03±3.022） 36.12±4.012）1.88±0.522）0.91±0.502）1.37±0.132）中剂量组 1029.21±2.012）38.95±3.102）0.97±1.012）1.62±0.412）3）2.35±0.112）3）低剂量组 1031.01±1.782）40.07±2.562）0.80±0.302）1.58±0.232）3）2.46±0.162）3）

新安医学作为中国传统医学的重要组成部分，在中医的发展史上做出了不可磨灭的贡献。以汪机为代表的新安医家师崇金元丹溪、东垣之学，但在学术上尊古而不泥古，在实践中辨证论治，提出了“调补气血，固本培元”的治疗思想，被后世尊称为“固本培元”派。

“固本培元”派临床治疗重视脾胃元气，通过使用参、芪等益气药物达到固本培元目的。为了进一步研究新安“固本培元”思想，揭示固本培元理论的现代医学机制，我们通过对汪机的《石山医案》用药规律进行筛选，发现汪氏组方配伍规律：以补气药为主要药物，常用配伍药物为补血药、清热药、理气药、补阴药、利水渗湿药等，并确定基本方固本培元方：人参 6 g，黄芪 20 g，白术 15 g，茯苓 12 g，当归 10 g，白芍 12 g，麦冬 12 g，陈皮 12 g，黄柏 10 g，黄芩 12 g，甘草6 g［2］。该方以四君子汤作为基础，方以人参大补元气，黄芪味甘能补，性温能升，为补气升阳的要药，配合人参补脾胃之气鼓舞清阳；白术苦温健脾燥湿，助运化，和胃气，善补后天之本，为补气健脾之要药；茯苓甘淡渗湿健脾，参苓术合用，健脾除湿之功更强，促其运化；陈皮辛散苦降，芳香醒脾，长于理气燥湿健脾，调中快膈；以当归、白芍调血和营，麦冬清热，黄柏、黄芩清热燥湿解毒，甘草甘温调中。全方共奏补气健脾、清热燥湿解毒之功能，该方在临床上用于溃疡性结肠炎、慢性浅表性胃炎等疾病辨证属脾虚者，多获良效。本课题探讨该方对脾虚型溃疡性结肠炎大鼠模型细胞因子的影响，从现代医学角度研究该方的作用机制，阐释其作用机理，为继承发扬新安医学做贡献。

大量研究表明，促炎细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α与抗炎细胞因子IL-10相互作用，若其平衡失调导致结肠组织免疫损伤，促进UC形成［3-5］。研究发现，活动性UC血清、结肠黏膜中TNF-α、IL-6、IL-8水平明显升高，这些细胞因子的表达和分泌与疾病的炎症程度呈正相关［4］。IL-10是一种强有力的抗炎因子，其主要生物学活性是抑制抗体产生炎症细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α，在维持细胞因子的平衡中起主要的调节作用，使肠黏膜炎症反应减弱，有利于组织的重建及修复。

本实验表明，与空白组比较，模型组大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α 水平均升高，而 IL-10的水平显著降低（P<0.01），说明造模成功。与模型组比较，SASP组、固本培元方各剂量组大鼠结肠黏膜损伤程度减轻，可能与血清 IL-6、IL-8、TNF-α水平降低，IL-10含量明显升高有关，且固本培元方降低TNF-α水平，减轻黏膜损伤的作用随剂量增加而增强。由此可见，新安固本培元方对脾虚型大鼠溃疡性结肠炎有较好的治疗作用，适于临床上进一步推广、应用。

［1］中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会.慢性非特异性溃疡性结肠炎中西结合诊断、辨证和疗效标准［J］.中国中西医结合杂志，2004，14（4）：239.

［2］袁静.《石山夜话》治疗脾气虚发热方剂优化整理研究［J］.中国中医药信息杂志，2006，27（5）：419-421.

［3］施嫣红.溃疡性结肠炎的免疫学研究进展［J］.疾病控制杂志，2006，10（3）：302-304.

［4］路晓红，杨恩来，赵霞，等.溃疡性结肠炎免疫机制的研究进展［J］.山西中医学院学报，2011，12（1）：35-36.

［5］Akazawa A，Sakaida I，Higaki S，et al.Increased expression of tumor necrosis factor-alpha messenger RNA in the intestinal mucosa of inflammatory bowel disease，particularly in patients with disease in the inactive phase［J］.J Gastroenterol，2002，37（5）：345-353.