免疫培养-凝集法快速检出痢疾杆菌的试验

徐飞

1、湖南省脑科医院 湖南 长沙 410007

2、湖南省疾病预防控制中心 湖南 长沙 410005

3、慈利县疾病预防控制中心 湖南 慈利 427200

免疫培养-凝集法快速检出痢疾杆菌的试验

徐飞1李剑2王鹏3

1、湖南省脑科医院 湖南 长沙 410007

2、湖南省疾病预防控制中心 湖南 长沙 410005

3、慈利县疾病预防控制中心 湖南 慈利 427200

目的：建立免疫培养-凝集法的快速检出痢疾杆菌方法，为疫情流行病学调查处理和病人早期诊断治疗提供病原学依据。方法将经大肠杆菌吸附后的福氏和宋内氏混合抗血清加入GN增菌肉汤培养液中，混匀后滴加于玻片凹处，再将离心沉淀后的粪便样品上清液接种于该培养液中，放入湿盒37℃培养4～6h，取出并肉眼观察玻片凹处培养液中的凝集菌团，凡发现一个凝集菌团即为阳性。每份样品以常规细菌培养法做平行试验。吸取凝集菌团并以细菌培养法进行验证试验。结果共检测111份菌痢和腹泻病人粪便样品，免疫培养-凝集法检出阳性41份，检出率为36.9%，与细菌培养法检出阳性的符合率达89.2%，两种检测方法的一致性为优(Kappa=0.763)。凝集菌团被证实为痢疾杆菌占82.9%。结论免疫培养-凝集法具有操作简便、快速、特异性好和敏感性高的优点，在疫情调查处理和病人的早期诊断治疗中具有一定意义。

免疫培养-凝集法；细菌培养；痢疾杆菌

细菌性痢疾是常见多发传染病，在聚集人群中常出现暴发和流行，因此快速检出病原菌对控制疫情和早期诊断治疗病人具有十分重要意义。本文采用免疫培养-凝集法，在实验室研究的基础上，检测111份菌痢病人和非菌痢病人粪便样品，现将方法和结果报告如下：

1 实验材料

1.1 菌种：F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6型福氏痢疾杆菌和宋内型痢疾杆菌，来自湖南省疾病预防控制中心和慈利县疾病预防控制中心检验室保存的菌株。

1.2 抗痢疾杆菌免疫血清的制备：按文献[1]用家兔分别制得F1a、F2a、F3a、F4a、F5、F6型和宋内氏七个型的免疫血清。试管凝集效价F1-F6均为1：3200，宋内氏为1：6400。用4株大肠杆菌(正常人粪便中分离出)的混合菌液(>30亿/ml)吸收2次，除去非特异性抗体，吸收后特异抗体效价为1:1200，实验时用稀释度为1:20。

1.3 GN增菌肉汤培养液、甘油缓冲盐水保菌液和SS培养基按常规法配制。

1.4 粪便标本：来自慈利县疾病预防控制中心、慈利县中医院门诊和住院病人，取粪便约1g，保存在甘油缓冲盐水保菌液中。

2 实验方法

2.1 粪便标本处理：已加入粪便的甘油缓冲盐水保菌液，混合后1000rpm离心10分钟，上清液作检验样品。

2.2 被吸收后的抗血清用GN增菌肉汤1:20稀释，取2滴加于载玻片两端的凹窝，取被检样品上清液1接种环于左侧混匀，再从中取一环于右侧混匀，置塘瓷温盒中37℃培养4～6小时后，取出肉眼观察结果，有1个以上灰白色絮状圆形凝集菌团为阳性，无凝集菌团为阴性。

2.3 病人粪便样品同时以常规细菌培养法作平行试验，以F2a和宋内氏菌株作阳性对照，并设阴性对照。

2.4 用微量注射器吸取凝集菌团，放入SS平皿中，用接种环划线，37℃培养18～24小时后，按常规法分离鉴定。

3 实验结果

3.1 免疫培养-凝集法和细菌培养法同时检测111份菌痢病人和腹泻病人粪便样品，免疫培养-凝集法的检出率为36.9%，与常规细菌培养法的检出率33.3%没有差别(P=0.388)，结果见表1。

3.2 两种检测方法一致的检出率为29.7%，以细菌培养法阳性样本为参考，两种检测方法检出符合率达89.2%。两种检测方法一致性为优(Kappa=0.763, P<0.001)，结果见表1。

表1 免疫培养-凝集法与细菌培养法检出痢疾杆菌结果

3.3 对41份免疫培养-凝集法阳性样品的凝集菌团进行纯培养鉴定，有34份被证实为痢疾杆菌占82.9%，其菌型与细菌培养一致，结果表明免疫培养-凝集法的检出结果是可靠的。

4 讨论

免疫培养-凝集法是将传统的细菌增菌培养与抗血清的凝集反应进行有机的结合，使痢疾杆菌在含有相应抗血清的液体培养基中生长的同时又不断的与相应抗体结合，进而成凝集性生长繁殖，可形成直径在100μm左右的灰白色特异性凝集菌团[2]，肉眼很容易观察到，从而使该方法具有操作简便、快速、特异性好、敏感性高的优点。

有4份常规细菌培养法阳性的样品，而免疫培养-凝集法则为阴性。这表明该方法存在病例诊断时的漏诊现象。造成的原因，一是这4份样品中有1份细菌培养法检出为痢疾志贺氏菌，不属免疫培养-凝集法使用的混合特异性抗血清检测范围所致。二是另有2份样品常规细菌培养法检出为未定型株，说明痢疾杆菌的抗原性变异亦是该方法漏诊的原因之一[3]。这方面有待进一步研究。

该方法使用的抗血清需经肠道菌吸附，以除去其它肠道菌的非特异性抗原[1]，另外GN增菌肉汤培养液，既有增菌培养作用，又有抑制粪便中其它肠道菌生长的使用[4]，以及接种时取经离心沉淀处理的上清液粪便样品，这些都是减少非特异反应的措施。

免疫培养-凝集法与细菌培养法具有很好的检出一致性，检出阳性时间只需4～6小时，克服了常规细菌培养法时间长的缺点，具有快速检出特点，对疫情的处理和病人的诊断治疗都有重要意义。

[1]上海市卫生防疫站．卫生防疫检验：细菌检验[M]．上海科学技术出版社，1979，23-35．

[2]鲁开国，陶秀莲，生菊，等．免疫微菌落染色法快速诊断霍乱弧菌研究[J]．中国卫生检验杂志，1994，4：202-204．

[3]张卓然，倪语星．临床微生物学和微生物检验[M]．3版，北京：人民卫生出版社，2003：119．

[4] 胡小玲，沈永芳．沙门-志贺菌增菌培养基的研究[J]．实用预防医学，2006，13(4)：1025-1026．

R446.13

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1009-6019(2014)08-0248-01