白头翁汤对痢疾杆菌的体外抑菌作用研究

王丽，陶兴宝，欧阳净，杨钟平

(重庆市公共卫生医疗救治中心，重庆 400036)

痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)又称志贺氏菌，为革兰氏阴性菌，无芽孢、无鞭毛，耐寒。可以在普通培养基上生长，形成中等大小、半透明的光滑菌落[1]。痢疾杆菌是导致人类及灵长类动物感染细菌性痢疾最为常见的病原菌，感染之后会出现以腹痛、腹泻、发热为特征的典型症状[2]。细菌性痢疾在我国被划归为乙类传染病，根据卫生部《全国细菌性痢疾监测方案》中报道，全球每年感染人次约为1.65亿，发达国家细菌性痢疾发病率约为1.8～6.5/10万，我国发病率为15.29/10万[3],明显高于其他发达国家。随着抗菌药物的广泛使用，痢疾杆菌对常用抗菌药物的耐药性大幅提高，细菌性痢疾的防治日趋困难。我国传统的中草药价格低廉、毒副作用小、耐药性低，越来越多的国内外研究者从中草药中筛选抗菌药物，探究其抑菌作用[4]。本文主要对白头翁汤对痢疾杆菌体外抑菌效果进行研究，旨在为防治细菌性痢疾提供用药参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药品和菌株来源

白头翁、黄连、黄柏和秦皮购置于本院中药房。痢疾杆菌由本院微生物实验室提供。

1.1.2 主要仪器和试剂

旋转蒸发器、无菌操作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、紫外分光光度计、电导率仪等。主要试剂：蛋白胨、牛肉膏、琼脂、氯化钠、蒸馏水等，由本院微生物实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养基的制备

液体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，调整pH值至7.4。固体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，琼脂18 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，调整pH值至7.4。

1.2.2 白头翁汤水相提取物的制备

称取白头翁150 g,黄柏120 g,黄连60 g和秦皮120 g加10倍蒸馏水于圆底烧瓶中，浸泡60 min后加热回流60 min，用纱布趁热过滤。药渣再分别加入8倍量蒸馏水和6倍量蒸馏水重复上述操作，合并滤液，减压浓缩成生药浓度为0.1 g/mL的药液，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 痢疾杆菌悬液的制备

在37 ℃条件下将痢疾杆菌菌种于24 h内反复活化3代，用血球计数板计数。加入液体培养基稀释制成含菌量为106cfu/mL的菌悬液，4 ℃冰箱保存备用[5]。

1.2.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定

将试管按顺序编号后置于试管架上，每管内加入2.0 mL无菌液体培养基，然后在第1管中加入2.0 mL灭菌的白头翁水提取物，混合均匀后取出2.0 mL加入第2管中，重复前述操作，直至第7管中取出2.0 mL液体丢弃，第8管作为阳性对照，不加入药液，以观察培养基是否适宜细菌生长。第9管中不加菌液，加入2.0 mL白头翁水提取物，作为阴性对照，以观察受试药液是否被污染。1～7号试管药液浓度分别为 128、64、32、16、8、4、2 mg/mL、阳性对照和阴性对照。然后向1～8号试管中分别加入0.1 mL痢疾杆菌菌悬液，混合均匀后放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h。如肉汤混浊，则表示细菌生长，如肉汤完全清亮，则表示无细菌生长。以无细菌生长的最低药液浓度作为白头翁汤对痢疾杆菌的MIC。实验重复3次。

1.2.5 最低杀菌浓度(MBC)的测定

吸取0.1 mL无细菌生长的各试管中培养液，接种到无药液的琼脂培养基上，轻轻推开，于37 ℃下培养。观察细菌生长情况，培养基中无细菌生长的最低药物浓度为白头翁汤的MBC。

1.2.6 白头翁汤作用下细菌细胞膜电导率的测定

将痢疾杆菌培养至对数生长期，然后接种到液体培养基中，并加入稀释后的白头翁汤水相提取物，使终浓度分别为32、64 mg/mL，此为实验组。对照组1为不加乙醇的溶液，对照组2为添加等体积乙醇的溶液。实验组和对照组分别摇床培养，在0，2，4，6，8 h取菌液，在转速为5 000 r/min下离心10 min，取其上清液，并用去离子水稀释20倍，测定稀释后的上清液电导率。实验重复3次，取平均值[6]。

1.2.7 细菌DNA含量检测

将痢疾杆菌培养至对数生长期，然后接种到培养基中，使培养液中白头翁汤的终浓度为2，4，6，8，16 mg/mL，选择无菌水为空白对照组，于37 ℃、130 rpm摇床中培养。培养12 h后分别取样品2 mL，转速为4 000 rpm条件下离心10 min，取上清液。用紫外分光光度计测上清液中DNA大分子的吸光度。实验重复3次，取平均值。

1.2.8 对苹果酸脱氢酶(MDH)和琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响

将2.5 mL Tris-HC(0.1 mol/L,pH值8.8)、0.1 mL苹果酸钠(0.1 mmol/L)、0.1 mL辅酶Ⅰ(10 mmol/L)依次加入石英比色皿中，快速加入粗酶液0.3 mL，引发反应。在340 nm波长下，每隔0.5 min用紫外可见分光光度计测定,连续3 min，以时间t(min)为横坐标、A340 nm为纵坐标作图，取整个反应过程中的线性部分来计算A340 nm/min的增殖，以每min A值增加0.01作为1个酶活力单位。用小牛血清蛋白对照，测定粗酶液中MDH的含量，按照公式求出MDH的比活性;SDH活性按试剂盒的操作步骤进测定。以小血清蛋白为对照，测定粗酶液中SDH的含量，按照公式求出SDH的比活性[7]。

MDH的比活性[U/(min·mg)]=(ΔA/0.01)/(反应时间×样品蛋白含量)

SDH比活性(U/mg)=酶活性/样品蛋白含量

2 结果

2.1 白头翁汤的最小抑菌浓度(MIC) 和最低杀菌浓度(MBC)

将体外抑菌及最小抑菌浓度的测定时间分别设为12 h和24 h， 利用白头翁汤水提取物的母液，分别将白头翁汤水提物稀释到2、4、6、8、16、32、64、128 mg/mL等梯度浓度，观察白头翁汤水提取物对痢疾杆菌的抑制作用，结果显示，其最小抑菌浓度MIC大概为32 mg/mL，重复实验3次，结果相同。参考五倍子、金银花、穿心莲等中药的MIC在125以上，表明白头翁汤水提物对痢疾杆菌具有较好的抑菌作用。结果见表1。

表1 白头翁汤提取物对痢疾杆菌MIC测定结果

进一步利用白头翁汤水相提取物的母液，分别将白头翁汤水相提取物稀释到2、4、6、8、16、32、64、128 mg/mL等梯度浓度，观察白头翁汤水提取物对痢疾杆菌的杀菌作用，结果显示，其最小杀菌浓度MBC大概为64 mg/mL，重复实验3次，结果相同。参考五倍子、金银花、穿心莲等中药的MBC在220以上，表明白头翁汤水相提取物对痢疾杆菌具有较好的杀菌作用。结果见表2。

表2 白头翁汤提取物对痢疾杆菌MBC测定

2.2 白头翁汤水相提取物对痢疾杆菌生长曲线的影响

为了进一步明确白头翁汤水相提取物对痢疾杆菌的影响，采取梯度浓度杀菌/抑菌检测法对白头翁汤的作用进行了研究，结果显示，阴性对照(即不加白头翁汤)对痢疾杆菌生长无作用，细菌出现了明显的指数级增长，采取MIC浓度的白头翁汤作用后(即32 mg/mL)，痢疾杆菌的生长曲线出现了明显的抑制；采取MBC浓度的白头翁汤作用后(即64 mg/mL)，痢疾杆菌出现了明显的杀灭效应，而且效应存在明显的时间梯度依赖性。这一结果表明，白头翁汤水相提取物对痢疾杆菌具有良好的抑菌和杀菌作用。见图1。

图1 白头翁汤水相提取物对痢疾杆菌的杀菌/抑菌曲线

2.3 测定细菌细胞膜的电导率

细菌的细胞膜结构为细胞的生命活动提供了相对稳定的内环境，同时参与细胞与周围环境中的物质交换，保持细胞内外渗透压的平衡。添加药物会对细胞膜的渗透性产生一定影响，表现为培养基电导率的改变。研究显示，与对照组相比，白头翁汤组随着作用时间延长及溶液浓度增加，电导率也显著增加，由此可见细菌体内有电解质渗出，表明白头翁汤可能破坏痢疾杆菌的细胞膜和细胞壁，从而抑制其生长。见图2。

图2 白头翁汤水相提取物对痢疾杆菌电导率的影响

2.4 白头翁汤作用痢疾杆菌后DNA含量的变化

细菌DNA含量是评价细菌活性和致病力的重要指标，笔者利用白头翁汤水相提取物的母液，分别将白头翁汤水相提取物稀释到2、4、6、8、16 mg/mL等梯度浓度，观察白头翁汤水相提取物对痢疾杆菌DNA含量的影响，OD值测定结果显示，随着浓度梯度的增高，痢疾杆菌DNA含量逐渐降低，并呈现出浓度依赖性，这一结果表明，白头翁汤水相提取物可以明显降低痢疾杆菌DNA含量。见图3。

图3 白头翁汤水相提取物对痢疾杆菌DNA含量的影响

2.5 白头翁汤对苹果酸脱氢酶(MDH)和琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响

苹果酸脱氢酶(MDH)和琥珀酸脱氢酶(SDH)是呼吸代谢中的关键酶，MDH和SDH的活性强弱可反映对细菌呼吸代谢的影响，研究结果见图4及图5。由图可见，在不同时间段，实验组MDH、SDH的比活性均明显低于空白组，但不同浓度组的比活性无明显变化。以上结果表明，白头翁汤提取物可以降低痢疾杆菌的苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的活性，影响细胞的呼吸代谢，从而影响细菌的正常繁殖。

图4 白头翁汤对苹果酸脱氢酶(MDH)活性的影响

图5 白头翁汤对琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响

3 讨论

白头翁汤其组方及煎服法：白头翁二两，黄连(去须)三两，黄柏(去皮)三两，秦皮三两，上四味，以水七升，煮取二升，去滓温服一升，不愈更服一升。该方组方严谨，具有清热解毒、凉血止痢等作用，主治湿热诸疾。方中白头翁为君，清热解毒、凉血止痢；黄连、黄柏、秦皮为臣，清热燥湿、泻火解毒。四药并用，可以加强清热止痢之功，为热毒血痢之良方，在临床中应用非常广泛[8]。目前该方临床主要用于治疗细菌性痢疾、阿米巴痢疾等症，尤其对于细菌性痢疾该方常作为治疗的首选方剂[9]。现代药理学研究表明，白头翁汤剂对细菌有明显抑制作用,能杀灭阿米巴原虫和阴道滴虫。故可用于相关感染性疾病的治疗，如细菌性痢疾、阿米巴痢疾、滴虫性阴道炎、泌尿道感染、阿米巴肝脓疡、急慢性盆腔炎、霉菌等[8]。

细菌性痢疾是痢疾杆菌引起的肠道传染病。痢疾杆菌经消化道感染人体后，引起结肠黏膜的炎症和溃疡，并释放毒素入血，使感染者出现腹泻、腹痛、里急后重的症状，该疾病在夏秋季发病率较高[10]，是我国的常见病、多发病，儿童和青壮年是高发人群。近年来，国家不断加大对卫生投入，以及抗菌药物的广泛使用，细菌性痢疾发病率和病死率都明显下降。但由于抗菌药物的滥用，耐药菌不断出现，导致该病发病率仍然处于较高水平，并且常有局部暴发流行的报道，给该病的防控及治疗带来了挑战。临床中常采用白头翁汤通过抑制痢疾杆菌治疗细菌性痢疾，疗效显著，作用可靠，对缩短病程，控制传染源，减少细菌性痢疾的发生具有重要意义。

目前的研究表明，中医药抑菌作用机制一般为改变细菌细胞膜、细胞壁通透性，通过抑制蛋白质、核酸表达及三羧酸循环，从而扰乱菌体生理代谢而实现抑菌或杀菌[11]。Yang等[12]通过阻滞凝胶电泳和原子力显微镜分析枯草芽孢杆菌DNA 与10-HAD的结合，探究10-HAD抑制枯草芽孢杆菌的抑菌机制，结果显示枯草芽孢杆菌的DNA与10-HAD有很强的结合力。Li等[13]通过流式检测P7对大肠杆菌细胞周期的影响，研究其对大肠杆菌抑菌机制，结果显示P7可阻滞大肠杆菌细胞周期的S期，使细胞周期发生紊乱，从而达到抑菌作用。Dwyer等[14]研究发现抗生素能够使细菌发生生理性细胞凋亡，其作用机制可能为抗生素作用菌体后使活性氧含量急剧上升。Dorsey-Oresto等[15]的研究表明，抑菌剂可以抑制Yih E基因的表达实现对细菌的抑制作用。

本研究对白头翁汤的抑菌机制进行了初步探讨，但其在人体中的作用如何，还需要新一步的动物实验和临床实验来证明。另外，笔者研究主要是针对白头翁汤水相提取物，至于白头翁其他溶液相的作用如何，比如正丁醇、乙醚等有机相的作用和效果如何，是否比水相具有更好的效果，尚需要进一步的研究证实。

4 结论

本研究表明，白头翁汤水相提取物对痢疾杆菌有一定程度的抑菌和杀菌作用，白头翁汤水相提取物可能破坏痢疾杆菌的细胞膜和细胞壁，从而抑制痢疾杆菌生长，其抑菌作用随着水相提取物浓度的增加、以及作用时间的延长而增强。即白头翁汤水相提取物对痢疾杆菌的抑制作用有着浓度和时间依赖性。白头翁汤也可通过降低痢疾杆菌DNA含量而达到抑菌作用。另一方面，白头翁汤水相提取物还可通过影响呼吸作用的关键酶比如苹果酸脱氢酶(MDH)和琥珀酸脱氢酶(SDH)来调控痢疾杆菌的生存或者死亡。