蒿甲醚对人恶性胶质瘤细胞的抑制作用

胡 宜, 王英滨,3, 薛一雪, 王 萍, 刘云会

(1.中国医科大学附属盛京医院 神经外科, 辽宁 沈阳, 110001;2.中国医科大学基础医学院 神经生物教研室, 辽宁 沈阳, 110001;3.沈阳医学院奉天医院 神经外科, 辽宁 沈阳, 110001)

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，具有侵袭性生长的特点，治疗困难，极易复发，预后很差[1]。传统治疗方法是手术切除，但术后平均生存期仅6个月，2年生存率不到7.5%[2]。因此放化疗已经成为胶质瘤的标准辅助治疗措施[2-4]。然而胶质瘤，特别是高级别的胶质瘤往往对普遍采用的化疗措施具有抵抗性[4-5]。因此寻找新的、更为有效的化疗药物对胶质瘤的治疗十分重要。蒿甲醚是广泛应用于抗疟疾治疗的中草药提取物[6]。近年来发现蒿甲醚可透过血脑屏障[7-8]，同时具有抗肿瘤作用[9-11]。本研究中，作者通过调查蒿甲醚对U251人胶质瘤细胞增殖、凋亡及磷酸Akt表达的作用，探讨其对胶质瘤的抑制作用及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

U251胶质瘤细胞株来自中国医科大学神经生物教研室。培养条件为含有10%胎牛血清(天津灏洋生物技术有限公司)的DMEM-F12培养基(Hyclone，USA), 37 ℃, 5%CO2的恒温培养箱。

1.2 MTT法测定细胞增殖活性

利用MTT法测定U251细胞的增殖活性[12]。取对数生长期的细胞，0.25%的胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。以5 000个/孔的浓度接种于96孔培养板。培养12 h后吸去培养液，对照组加入无血清DMEM-F12培养基；实验组分别加入含浓度为0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 μmol/L的蒿甲醚(云南昆明制药厂)。培养24、48 h后加入20 μL MTT (5 mg/mL) 。继续孵育4 h，弃孔内液体，加入150 μL DMSO，震荡10 min。利用酶标仪测定波长490 nm时各孔光吸收值。

1.3 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡

U251细胞的凋亡通过Annexin V-FITC/PI试剂盒(南京凯基生物科技有限公司)测定。取对数生长期的细胞接种于6孔板中，加入浓度为0 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L, 800 μmol/L的蒿甲醚培养48 h, 用0.25%的胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液制成单细胞悬液。PBS洗涤2次后离心(1 000 rpm, 5 min)，收集5×105个细胞，加入500 μL的BindingBuffer悬浮细胞。利用5 μL Annexin V-FITC和5 μL PropidiumIodide室温避光染色15 min。在流式细胞仪上检测，左下象限LL代表正常细胞(Annexin V-, PI-), 左上象限UL代表细胞收集过程中的损伤细胞(Annexin V-, PI+), 右上象限UR代表晚期凋亡细胞和坏死细胞(Annexin V+, PI+); 右下象限LR代表早期凋亡细胞(Annexin V+, PI-)。

1.4 蛋白印迹(Western blot)

细胞分组及培养同前。U251细胞以预先冰冷的PBS冲洗3次，利用细胞刮刀收集于离心管中，加入适量RIPA裂解液(碧云天)，冰上裂解30 min，然后超声粉碎。4 ℃条件下以17 000 g离心60 min, 含有蛋白的上清被收集到新管中。以牛血清白蛋白为标准，利用BCA试剂盒(碧云天)测定蛋白浓度。蛋白上样量为25 μg, 利用10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)凝胶电泳进行蛋白分离。转膜后以山羊抗人Akt1/2多克隆抗体，兔抗人p-Akt 1/2/3 (Ser473)多克隆抗体及小鼠抗人β-actin多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)封闭过夜。兔抗山羊、山羊抗兔及山羊抗小鼠的辣根过氧化物酶标记的二抗(中山金桥生物技术公司)按1∶5 000比例稀释后室温孵育2 h，利用ChemiImager 5500 V2.03软件检测，并测定积分光密度值，计算目的基因与β-actin的积分光密度相对比值并进行数学统计。

2 结 果

2.1 蒿甲醚抑制U251细胞的增殖

作者利用不同浓度的蒿甲醚孵育U251细胞，然后以MTT法测定细胞增殖活力。结果显示蒿甲醚以剂量依赖的方式抑制U251细胞生长；蒿甲醚处理U251细胞48 h，在400 μmol/L及更高浓度组细胞增殖活性受到显著抑制，并且随着浓度增高抑制作用增强。作用时间为24 h的IC50为(868.47±9.2) μmol/L，48 h的IC50为(384.81±13.8) μmol/L。见图1。

图1 不同浓度蒿甲醚对U251细胞增殖能力的影响

2.2 蒿甲醚促进U251细胞的凋亡

作者利用浓度为0 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L, 800 μmol/L的蒿甲醚作用于U251细胞48 h后，应用Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡，检测蒿甲醚对U251胶质瘤细胞凋亡能力的影响。结果显示，各组凋亡率分别为(4.87±0.62)%, (8.12±0.65)%, (13.86±9.05)%, (18.55±0.92)%(图2)。与对照组相比, 200 μmol/L, 400 μmol/L和800 μmol/L的蒿甲醚显著促进U251细胞的凋亡，并且浓度越高促进作用越强(图2)(P<0.01)。与0 μmol/L组相比，*P<0.05。

与0 μmol/L组相比，*P<0.05;

2.3 蒿甲醚抑制U251细胞p-Akt蛋白表达

不同浓度的蒿甲醚作用于U251细胞48 h后，应用Western Blot方法检测p-Akt蛋白的表达。如图3所示，与0 μmol/L组相比, 200 μmol/L的Artemether未对p-Akt/Akt产生影响(P>0.05), 400 μmol/L和800 μmol/L的Artemether分别显著降低p-Akt/Akt蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)。

3 讨 论

本研究中，作者首先发现蒿甲醚以剂量依赖方式显著抑制了U251人脑胶质瘤细胞的增殖活性，并明显促进了U251细胞的凋亡。在进一步的研究中，作者发现蒿甲醚显著抑制了U251细胞p-Akt的表达，提示蒿甲醚对胶质瘤细胞的抑制作用可能与抑制Akt信号通路有关。

与0 μmol/L组相比，*P<0.05;

胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，生物学特性是恶性度高, 增殖旺盛，极易发生侵袭转移[13]。胶质瘤传统治疗方法仍为手术切除, 但手术全切困难，极易复发，预后不佳[1]。因此辅助化疗已经成为胶质瘤治疗的标准辅助措施。青蒿素是1971年被中国科学家从中草药中提取出的抗疟疾药物[14]。蒿甲醚是青蒿素最重要的甲基乙醚衍生物，被广泛应用于疟疾，特别是抗药性疟疾的治疗中[6，15]。近年来的研究[16]发现，蒿甲醚同时具有抑制周围系统肿瘤增殖、血管新生的作用，并可诱导肿瘤细胞的凋亡[9]。例如蒿甲醚对人肝癌细胞具有细胞毒性，还可通过引起DNA破坏而诱导人胃癌PG1100细胞的凋亡和坏死[10]。然而，蒿甲醚针对中枢神经系统恶性肿瘤的作用及机制研究很少。有学者研究[11]发现蒿甲醚可以减少C6大鼠胶质瘤细胞移植肿瘤的血管床密度和体积。体外研究[17]发现蒿甲醚能够明显抑制小鼠Nb2a胶质母细胞和C6大鼠胶质瘤细胞的增殖。在本研究中，作者首先利用浓度分别为0、50、100、200、400、600及800 μmol/L蒿甲醚作用于U251细胞，然后以MTT法观察蒿甲醚对U251细胞增殖活力的影响。结果显示0，200 μmol/L浓度未显示出对胶质瘤的抑制作用，而400 μmol/L以及更高浓度的蒿甲醚则显著抑制其增殖活性，并且随着浓度的增高抑制作用也在增强。该结果说明蒿甲醚以剂量依赖的方式抑制U251人胶质瘤细胞的增殖。作者进一步的研究结果显示，蒿甲醚还促进了胶质瘤细胞凋亡。结合之前的研究，可以看出蒿甲醚具有成为胶质瘤治疗药物的潜力。

蒿甲醚抑制胶质瘤细胞的作用机制还不明确。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信号通路在多种重要的细胞生命活动，如细胞存活、增殖、趋化等过程中发挥作用[18]。PI3K/Akt信号通路与多种肿瘤的生物学行为密切相关，在卵巢癌，乳腺癌，子宫内膜癌等多种恶性肿瘤中，该信号通路被激活而抑制肿瘤细胞凋亡[19-22]。抑制PI3K/Akt信号通路可抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭及转移，并可促进其凋亡[23-25]。在本研究中，作者发现蒿甲醚显著抑制了U251胶质瘤细胞磷酸化Akt的表达水平。结合之前的研究，可以认为蒿甲醚是通过抑制胶质瘤细胞Akt信号通路而发挥抗肿瘤效应的。

综上所述，本研究发现蒿甲醚能够呈剂量依赖的方式抑制人U251胶质瘤细胞的增殖活性、促进胶质瘤细胞的凋亡，同时发现该抑制作用可能系通过抑制胶质瘤细胞的Akt信号通路而实现。本研究的结果为中草药成分蒿甲醚进一步应用于胶质瘤的治疗提供了理论依据。

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