脐血干细胞移植结合补益肾气利湿法对ChildA、B级肝硬化患者免疫功能的影响

周晓玲, 谢 胜, 陈 峭, 侯秋科

(广西壮族自治区柳州市中医院 消化科, 广西 柳州, 545001)

肝硬化是临床常见的严重疾病，一直以来缺乏有效的治疗手段。近年来，干细胞移植技术在治疗肝硬化的治疗方面取得了一定的进展，引起了学术界的广泛关注。柳州市中医院消化科应用脐血干细胞移植治疗各期肝硬化患者均取得了一定的疗效[1]。同时，在长期的临床实践过程中我们发现，行脐血干细胞移植治疗的同时配合补益肾气利湿法可取得更为满意的疗效。本文拟观察脐血干细胞移植联合补益肾气利湿法治疗ChildA、B级肝硬化患者治疗前后体内T细胞亚群、红细胞免疫相关指标及肝组织病理学检查的变化情况，总结该疗法的临床疗效并探讨其可能的作用机制，促进该疗法在临床的推广应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2011年11月—2012年11月在柳州市中医院住院的50例ChildA、B级肝炎后肝硬化患者为研究对象。严格参照《实用内科学》第14版肝硬化的相关诊断内容[2]进行诊断，通过CT检查、肝组织活检，并根据肝硬化Child-Pugh计分及评级标准筛选病例。其中男28例，女22例；年龄27～72岁，平均(48.2±3.1)岁; Child A级30例，Child B级20例。随机分为治疗组和对照组，每组25例，2组患者的性别、年龄、Child-Pugh分级等一般资料无显著差异(P>0.05), 具有可比性。所有治疗措施都在患者知情同意并签署《知情同意书》情况下进行。

1.2 方法

1.2.1 术前准备：患者入院后均行内科对症治疗，行肝脏生化学、病毒学检查、肝脏CT及肝组织病理学检查。

1.2.2 脐血干细胞移植治疗: ① 脐血采集及分离：选择足月产妇，产前检查正常，产后无新生儿畸形。产后留脐血80～120 mL, 2～4 ℃保存, 12 h内在万级洁净实验室百级超净工作台内，由从事细胞分离的专业人员按试剂盒说明书要求分离脐血干细胞; ② 移植方法及术后处理：在介入治疗室内，经股动脉穿刺插管，置管于肝固有动脉进行数字减影血管造影(DSA)，观察肝内血管情况及有无占位性病变。经肝固有动脉将分离好的干细胞悬液10 mL缓慢注入(2 mL/min), 术毕拔管，穿刺点加压包扎后返回病房。术后股动脉穿刺点压迫止血12 h, 穿刺侧下肢制动6 h。术后常规监护，并继续抗病毒、保肝及对症支持治疗。

1.2.3 补益肾气利湿法：干细胞移植术治疗前后各服用济生肾气汤1个月。处方：熟地黄80 g、山茱萸40 g、山药40 g、泽泻30 g、茯苓30 g、丹皮30 g、肉桂10 g、附子10 g、车前子20 g、牛膝20 g。以上药物均由中药煎煮机(天津三延公司生产)进行煎煮，一剂浓煎为2袋，每袋180 mL。

1.2.4 检测方法：所有患者均清晨抽取空腹外周血2 mL, 肝素抗凝，按T细胞亚群免疫荧光检测试剂盒(德国Partec公司)进行操作，测定CD4+T细胞、CD8+T细胞，结果采用FloMax专用软件进行分析；采用郭峰法检测红细胞C3b受体黏附花环率(RBCoC3bRR)、红细胞免疫复合物花环率(RBCoICR)等红细胞免疫功能；术前及术后第12个月超声引导下行肝穿刺活体组织检查术，肝组织标本采用中性甲醛液固定，常规石蜡包埋切片，苏木精-伊红、网状(Gorelen Sweet法)和胶原(VG法)染色，病理观察。

1.3 观察指标

观察肝组织病理切片，作出分级、分期病理诊断，并计算炎症和纤维化计分；观察治疗前及治疗后第3、6、12个月RBCoC3bRR、RBCoICR以及T淋巴细胞亚群。

2 结 果

2.1 2组肝组织病理学检查

治疗后12个月，2组炎症计分及纤维化计分均显著下降(P<0.01), 治疗后，2组间比较，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01), 见表1。

表1 2组治疗前后肝组织病理学检查结果的比较±s, 分)

2.2 2组治疗前后红细胞免疫相关指标比较

与治疗前相比，治疗后2组RBCoC3bRR、红细胞免疫黏附促进率(RFER)显著升高, RBCoICR、红细胞免疫黏附抑制率(RFIR)显著下降(P<0.01); 治疗后, 2组各指标比较，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 2组治疗前后红细胞免疫相关指标比较±s)

2.3 2组治疗前后T细胞亚群比较

与治疗前相比，2组治疗后外周血T细胞亚群中CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞/CD8+T细胞均显著上升(P<0.05或P<0.01), 且治疗组上升幅度更大。见表3。

表3 两组治疗前后外周血T细胞亚群检测结果±s)

3 讨 论

大量研究发现，间充质干细胞具有横向分化能力，在一定的条件下可分化为肝细胞和干细胞从而参与肝脏的修复与重建，这为肝硬化的治疗提供了新的途径[3]。脐血有着充足的间充质干细胞来源，免疫原性较弱，且其间充质干细胞更为原始，扩增性能更强，可作为一种新的替代细胞来源，用于各系统疾病的细胞移植[4-5]。本科应用脐血干细胞移植治疗各期肝硬化疗效显著，前期研究显示，采用脐血源性干细胞移植治疗失代偿期肝硬化患者后，其临床症状明显改善，胸、腹水消失，下肢浮肿减轻，食欲改善，乏力好转，腹胀减轻, Child-Pugh计分较治疗前明显降低，临床总有效率达75.6%[1]。本研究亦表明，采用脐血源性干细胞移植治疗ChildA、B级肝硬化患者，其肝组织炎症计分、纤维化计分均显著降低，提示了肝硬化患者的肝脏炎症得到明显改善，肝组织纤维化程度在一定程度上逆转，这与我们的前期研究成果亦是一致的。

T淋巴细胞亚群在肝细胞损害、机体抗肿瘤免疫中起着非常重要的作用。T淋巴细胞的两个功能亚群，即CD4+T细胞的辅助功能亚群、CD8+T细胞的抑制及杀伤功能亚群，具有调节整个机体免疫功能的作用，其数量、比例和功能的改变都可能影响着机体的免疫状态[6]。同样，红细胞具有多种非特异性免疫受体和物质，不仅能识别、储存、杀伤抗原、清除循环免疫复合物，还参与机体的免疫调控，在机体非特异性免疫反应中占有重要的地位[7]。当肝细胞严重受损时，肝脏合成功能减退，红细胞免疫功能受损，表现为以红细胞

C3b受体降低和红细胞免疫复合物增高为主的免疫损伤[8]。研究表明，脐血干细胞移植治疗后外周血T细胞亚群相关指标得到显著改善，RBCoC3bRR、RFER显著提高，RBCoICR、RFIR显著下降，提示脐血干细胞移植疗法可能是通过参与T淋巴细胞、红细胞等免疫调控过程而改善肝硬化。

同时，本研究还发现配合中医补益肾气利湿法可进一步提高干细胞移植治疗的疗效。中医药对肝纤维化与肝硬化的治疗本身就具有一定优势，近年来已有多个抗肝纤维化经验方药与中药新药问世并广泛用于临床，其基本中医治则为“扶正化瘀”[9]。现代药理研究发现，肾气丸具有抗衰老、免疫调节、影响造血系统等多重作用[10-11]。本研究结果亦表明，采用脐血源性干细胞移植联合补益肾气利湿法治疗的肝硬化，患者红细胞免疫、T细胞亚群等相关指标得到了显著改善，与单用脐血源性干细胞移植治疗方案比较具有显著差异(P<0.01)，且在最终的治疗效果上，联合治疗方案的肝组织炎症及纤维化程度计分改善要远优于对照组(P<0.01)。表明补益肾气利湿法具有强大的免疫调控功能，与干细胞移植同时运用可起到免疫功能协同增效的效果，并可能对干细胞移植后定植及增强细胞活性起到积极的调控作用。

[1] 周晓玲, 谢胜, 侯秋科, 等.脐血干细胞移植治疗失代偿期乙型肝炎肝硬化的临床研究[J].成都医学院学报, 2013, 8(5): 571.

[2] 陈灏珠, 林果为, 王吉耀.实用内科学(第14版)[M].北京: 人民卫生出版社, 2013: 259.

[3] Lin H, Xu R, Zhang Z, et al.Implications of the immunoregulatory functions of mesenchymal stem cells in the treatment of human liver diseases[J].Cellular & molecular immunology, 2010, 8(1): 19.

[4] Maurya D K, Doi C, Pyle M, et al.Non-random tissue distribution of human nae umbilical cord matrix stem cells[J].World journal of stem cells, 2011, 3(4): 34.

[5] Uppalapati D, Ohta N, Zhang Y, et al.Identification and characterization of unique tumoricidal genes in rat umbilical cord matrix stem cells[J].Molecular pharmaceutics, 2011, 8(5): 1549.

[6] Koch M, Beckhove P, op den Winkel J, et al.Tumor infiltrating T lymphocytes in colorectal cancer: Tumor-selective activation and cytotoxic activity in situ[J].Annals of surgery, 2006, 244(6): 986.

[7] 郭峰, 钱宝华, 张乐之.现代红细胞免疫学[M].上海: 第二军医大学出版社, 2002: 61.

[8] 秦继宝.肝硬化患者红细胞免疫功能与脂质过氧化关系的研究[J].医学动物防制, 2007, 23(5): 344.

[9] 刘成海, 刘平, 胡义扬, 等.中医药抗肝纤维化临床与基础研究进展[J].世界科学技术: 中医药现代化, 2007, 9(2): 112.

[10] 陈社带, 杨慧文.金匮肾气丸对STZ糖尿病模型大鼠免疫功能的影响[J].辽宁医学院学报, 2013, 34(2): 20.

[11] 刘妍, 张平, 李明, 等.补肾方对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠T辅助细胞1, 17和调节性T细胞的影响[J].中国实验方剂学杂志, 2011, 17(3): 116.