应用免疫组织化学检测EphA2及其调节基因HoxA1、C-myc在喉癌组织中的表达及相互关系

石栋梁，杜 涛，习国平(.河北省邯郸市第三医院耳鼻咽喉-头颈外科，河北 邯郸 05600;.河北省邯郸市第二医院内窥镜室，河北 邯郸 05600)

·论著·

应用免疫组织化学检测EphA2及其调节基因HoxA1、C-myc在喉癌组织中的表达及相互关系

石栋梁1，杜 涛2，习国平1
(1.河北省邯郸市第三医院耳鼻咽喉-头颈外科，河北 邯郸 056001;2.河北省邯郸市第二医院内窥镜室，河北 邯郸 056001)

目的探讨同源异形盒基因A1(homeobox genes A1,HoxA1)、癌基因(cancer-myc,C-myc)、促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2,EphA2)与喉癌发生发展的关系，从分子生物学角度探讨喉癌的发病机制。方法40例喉癌组织及40例癌旁组织，取15例非喉癌患者的喉部正常黏膜组织做对照。所有肿瘤经病理检查证实为鳞状细胞癌，癌旁组织和正常组织取材经病理检查证实为炎症或正常。应用免疫组织化学检测喉癌组织、癌旁组织及喉部正常黏膜组织中EphA2、HoxA1、C-myc阳性表达率。结果EphA2、HoxA1、C-myc在喉癌组织中的阳性表达率分别高于癌旁组织和正常喉黏膜组织，而癌旁组织与正常喉黏膜组织间的表达差异无统计学意义。结论EphA2蛋白、HoxA1蛋白、C-myc蛋白在喉癌中的表达与喉癌的发生、发展有关。

喉肿瘤；基因表达；免疫组织化学

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.09.009

喉癌的发生发展与多种癌调节基因及信号转导通路的改变有关，其中促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(erythropoietin-producinghepatocellularreceptorA2,EphA2)与癌细胞增殖、发展有关。同源异形盒基因A1(homeoboxgenesA1,HoxA1)作为细胞增殖分化的调节基因,不仅调控胚胎细胞的增殖和分化,而且也是成人组织细胞增殖和分化的重要调节基因；若HoxA1发生异常表达,就会导致个体发育和组织器官形成过程中出现异常的形态结构,并可致细胞恶性转化形成肿瘤。癌基因(Cancer-myc,C-myc)属于核蛋白类调控基因,其在细胞周期变化、细胞的生长代谢、基因的不稳定性、刺激血管生成、细胞恶性转化、分化及凋亡中起重要的调节作用。EphA2的表达受到许多基因的调控。本研究从分子水平探讨HoxA1、C-myc、EphA2与喉癌发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2006年8月—2013年8月河北省邯郸市第三医院经手术切除的喉癌组织40例及相应癌旁组织40例，非喉癌患者的喉部正常黏膜组织15例做对照。喉癌患者中男性37例，女性3例；年龄40～72岁，中位年龄56岁；所有肿瘤经病理检查证实为鳞状细胞癌，其中有淋巴结转移者12例，无淋巴结转移者28例；临床分期Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期24例，其中T1N0M0 6例，T2N0M0 10例，T2N1M0 2例，T2N2M0 1例，T3N0M0 9例，T3N1M0 2例，T3N2M0 6例，T4N0M0 3例，T4N2M0 1例。癌旁组织和正常黏膜组织取材经病理检查证实为炎症或正常。所有标本取材后立即用液氮冷藏保存。正常黏膜患者中男性8例，女性7例，年龄32～56岁，中位年龄41岁，均为声带息肉病。

1.2 方法：石蜡标本常规4μm连续切片，平铺于载玻片上，放于60℃烤箱4h。浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10min。100%、90%、70%梯度酒精各5min，自来水冲洗，蒸馏水3min。3%H2O2及甲醇中室温孵育15～20min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水3min×3次，0.01mol/LPBS5min。抗原修复，EphA2、HoxA1、C-myc采用枸橼酸盐缓冲液高压锅加热2min进行抗原修复。室温冷却30min，放入PBS内10min。吸去余液，擦净载玻片。正常山羊或兔血清封闭，37℃湿盒内孵育40min。倾去血清，滴加EphA2、HoxA1、C-myc一抗，浓度按1∶100稀释，4℃过夜。0.01mol/LPBS冲洗5min×3次。滴加第2代生物素标记的二抗工作液，37℃湿盒内孵育25min。0.01mol/LPBS冲洗5min×3次。滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37℃湿盒内孵育25min。0.01mol/LPBS冲洗5min×3次。DAB液显色。苏木精复染，常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下观察。

1.3 结果判定：EphA2和HoxA1判断标准相同，阳性染色定位于细胞质。光镜(10×40倍)下，随机选择5个视野，采用双评分，按阳性细胞百分率评分，<10%为0分，≥10%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%为3分；按染色强度评分，无着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。然后按阳性分乘以染色分计总分，总分为0判为“-”，总分<3分判为“+”，3～6分判为“++”，>6分判为“+++”。“+”～“+++”为阳性表达。

C-myc阳性定位于细胞质和细胞核。按染色强度和阳性细胞百分率评分，<10%为0分，≥10%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%为3分；按染色强度评分，无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。总分等于0为阴性，总分1～2为弱阳性，总分3～4为阳性，总分>4为强阳性。

癌组织染色强度≥3或癌组织虽然染色强度=2但阳性细胞百分率≥10%皆归为有表达，癌组织染色强度≤1，不论阳性率多大，皆归为无表达。

由3位独立观察者阅片，根据其评分的平均值确定判定结果。

1.4 统计学方法：应用SPSS11.5统计软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

喉癌组织中EphA2蛋白、HoxA1蛋白和C-myc蛋白阳性表达率高于正常黏膜组织及癌旁组织(P<0.05)，而癌旁组织与正常黏膜组织比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 EphA2、Hoxa1和c-myc在癌组织及癌旁组织、正常黏膜组织中的表达Table 1 Expression of EphA2,HoxA1 and C-myc in laryngeal carcinoma,para-carcinoma tissues and normal mucosa tissues (n，%)

*P<0.05vsnormal mucosa tissues #P<0.05vspara-carcinoma tissues by χ2test

3 讨 论

Eph受体是酪氨酸蛋白激酶受体家族中最大的分支，有对细胞增殖的调节作用。EphA2的过度表达具有转化正常细胞的能力，当Eph-ephrin系统正常表达时可抑制细胞增生，异常表达时又可以促进细胞的转化。Fujii等[1]将重组ephrinA1绑定到石川细胞的表面，而致EphA2及A4磷酸化。Hox基因不仅调控胚胎细胞的增殖和分化,而且也是成人组织细胞增殖和分化的重要调节基因。若Hox基因发生异常表达,就会导致个体发育和组织器官形成过程中出现异常的形态结构,并可致细胞恶性转化形成肿瘤。C-myc原癌基因激活的主要方式是该基因的扩增和过表达,证明其在细胞周期变化、细胞的生长代谢、基因的不稳定性、刺激血管生成、细胞恶性转化、分化及凋亡中起重要的调节作用。肿瘤细胞为了生长和转移必须获得血液供应，通常认为通过新生血管满足其血液供应。

细胞迁移是肿瘤侵袭和转移的重要环节，细胞与细胞外基质的黏附与解离是其必要的步骤。多种Eph受体及配体在肿瘤中尤其是肿瘤生长的高侵袭性阶段有正调节作用。EphA2的过度表达不仅能导致正常细胞的恶性转化，而且能增强肿瘤细胞向外侵袭的能力，这是通过削弱肿瘤细胞之间的连接，增加肿瘤细胞与细胞外基质成分的黏附和增强在基质的侵袭等方面实现的。任舒灵等[2]研究表明EphA2可降低鼻咽癌细胞对紫杉醇的药物敏感性。

Karidis等[3]研究发现EphA2与甲状腺肿瘤生成有关。EphA2的表达增高与疾病分期及预后都有一定关系，因此，EphA2可以作为一个独立的诊断指标。Fujii等[4]采用印迹分析证实人类子宫内膜EphA2蛋白的存在。Brantley-Sieders等[5]研究表明EphA2在肿瘤新血管形成及侵袭转移中起很重要的作用。Cheng等[6]研究表明，阻断EphA2受体酪氨酸激酶可以抑制血管内皮生长因子诱导的血管生成。靳文剑等[7]研究表明肝细胞癌组织中EphA2蛋白表达上调,且其表达上调与肝癌的恶性病理特征及术后复发相关,提示EphA2蛋白可能在肝癌进展和转移中发挥重要作用。

HoxA1可控制细胞周期，通过结合蛋白磷酸酶2A和蛋白磷酸酶1的催化亚基发挥作用。这种结合启动G2停止期的非洲蟾蜍卵母细胞以及G2停止期、DNA受损的Jurket细胞(注：属急性T细胞白血病细胞系)进入M期。Kang等[8]研究表明HoxA1在胃癌细胞的表达明显高于癌旁正常黏膜上皮，成为胃癌DNA甲基化标记物之一。Tsou等[9]研究表明HoxA1在肺腺癌细胞中的超甲基化水平远高于正常细胞(P<0.01)。但HoxA1在喉癌中的表达未见报道。

本研究结果与应用流式细胞术研究结论相似[10]。C-myc基因扩增量与C-myc蛋白表达量无关，C-myc蛋白表达在淋巴结阴性组中高于淋巴结阳性组可能是由于随着肿瘤细胞的进展其mRNA变得更加不稳定所致。C-myc对EphA2的下调在乳腺上皮细胞中有效，而在癌细胞中EphA2对C-myc却不敏感。C-myc和EphA2在喉癌中的因果关系以及其机制有待于进一步研究。本研究结果显示EphA2和HoxA1、C-myc在喉癌组织中的表达情况，其可能参与肿瘤的恶性转化过程，调节肿瘤细胞的增殖和分化，提示将来通过调节这些蛋白的表达可能在喉癌的临床治疗中有一定应用价值。

尽管关于喉癌的此类研究较少，但是我们推测EphA2和HoxA1、C-myc蛋白的表达变化与喉癌的发生、生长和转移有关，其在喉癌组织中的表达情况可能预示癌细胞的侵袭与转移，EphA2和HoxA1、C-myc蛋白的表达可能对判断喉癌的恶性程度、病情进展有重要价值。

总之，喉癌细胞中EphA2和HoxA1、C-myc共同促进了喉癌的发生发展，为喉癌的诊断和治疗提供了一个新的靶点。因此，深入研究EphA2和HoxA1、C-myc的生物学作用及其作用机制，进而选择最佳靶位，可能为封闭、阻断喉癌的发生发展提供更有力的依据。

[1] FUJII H,FUJIWARA H,HORIE A,et al.EphrinA1 stimulates cell attachment and inhibits cell aggregation through the EphA receptor pathway in human endometrial carcinoma-derived Ishikawa cells[J].Hum Reprod,2011，26(5):1163-1170.

[2] 任舒灵，刘勇，李果，等.EphA2 蛋白调控鼻咽癌紫杉醇敏感性的实验研究[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志,2013,19(1):28-31,37.

[3] KARIDIS NP,GIAGINIS C,TSOUROUFLIS G,et al.Eph-A2 and Eph-A4 expression in human benign and malignant thyroid lesions: an immunohistochemical study[J].Med Sci Monit,2011，17(9):257-265.

[4] FUJII H,FUJIWARA H,HORIE A,et al.Ephrin A1 induces intercellular dissociation in ishikawa cells: possible implication of the Eph-ephrin A system in human embryo implantation[J].Hum Reprod,2011，26(2):299-306.

[5] BRANTLEY-SIEDERS DM,FANG WB,HICKS DJ,et al.Impaired tumor microenvironment in EphA2-deficient mice inhibits tumor angiogenesis and metastatic progression[J].FASEB J,2005,19 (13):1884-1886.

[6] CHENG N,BRANTLEY DM,LIU H,et al.Blockade of EphA receptor tyrosine kinase activation inhibits vascular endothelial cell growth factor-induced angiogenesis[J].Mol Cancer Res,2002,1(1):2-11.

[7] 靳文剑，张焜和，陈火国，等.EphA2在肝细胞癌中的表达及临床意义[J].重庆医学,2013,42(20):2361-2363.

[8] KANG GH,LEE S,CHO NY,et al.DNA methylation profiles of gastric carcinoma characterized by quantitative DNA methylation analysis[J].Lab Invest,2008,88(2):161-170.

[9] TSOU JA,GALLER JS,SIEGMUND KD,et al.Identification of a panel of sensitive and specific DNA methylation markers for lung adenocarcinoma[J].Mol Cancer,2007,6:70.

[10] 石栋梁,杜涛,习国平.应用流式细胞术检测EphA2及其调节基因HoxA1、C-myc在喉癌组织中的表达及相互关系[J].河北医科大学学报,2013,34(3):294-297.

(本文编辑：赵丽洁)

EXPRESSIONANDRELATIONSOFEphA2,HoxA1ANDC-mycINLARYNGEALCARCINOMAWITHIMMUNOHISTOCHEMICALSTAINING

SHIDongliang1,DUTao2,XIGuoping1
(1.DepartmentofOtolaryngology,theThirdHospitalofHandan,HebeiProvince,Handan056001,China;2.EndoscopyRoom,theSecondHospitalofHandan,HebeiProvince,Handan056001,China)

ObjectiveThestudyexploredtherelationofhomeoboxgenesA1(HoxA1),cancer-myc(C-myc)anderythropoietin-producinghepatocellularreceptorA2(EphA2)withlaryngealcarcinomaforthegenesismechanismoflaryngealcarcinomaatthelevelofmolecularbiology.MethodsFortylaryngealcarcinomafreshsampleswereanalyzedandmeanwhile40para-carcinomatissuesand15normallaryngealmucosasampleswerealsostudiedascontrols.Alltumortissueswereconfirmedtobesquamous-cellcarcinoma;thepara-carcinomatissuesandnormalmucosawereconfirmedtobeinflammatoryornormalmucosapathologically.TheexpressionofEphA2,HoxA1andC-mycproteinweremeasuredinlaryngealcarcinoma,para-carcinomatissuesandnormallarynnealmucosatissueswiththeimmunohistochemicalstaining.ResultsTheexpressionsofEphA2,HoxA1,C-mycinlaryngealcarcinomatissuesweresignificantlyhigherthanthoseofpara-carcinomaandinnormallaryngealmucosatissues,respectively.Therewasnosignificantdifferencebetweentheexpressionsofpara-carcinomaandnormallaryngealmucosatissues.ConclusionTheexpressionsofEphA2,HoxA1andC-myccontributetothecarcinogenesisanddevelopmentoflaryngealcarcinoma.

laryngealneoplasms；geneexpression；immunohistochemistry

2013-10-15；

2014-02-12

石栋梁(1971-)，男，河北魏县人,河北省邯郸市第三医院主治医师，医学硕士，从事耳鼻咽喉头颈外科疾病诊治研究。

R739.65

A

1007-3205(2014)09-1018-04