过氧化物酶体增殖物激活受体γ在保护大鼠脑缺血中的作用

祝春华，温 雅，王力娜，季 辉，杨 燚，刘 莹 (河北医科大学第二医院神经内科，河北 石家庄 050000)

·论著·

过氧化物酶体增殖物激活受体γ在保护大鼠脑缺血中的作用

祝春华，温 雅，王力娜，季 辉，杨 燚，刘 莹
(河北医科大学第二医院神经内科，河北 石家庄 050000)

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)对大鼠脑缺血的保护作用及其机制。方法线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。实验分为假手术组、溶剂对照组、替米沙坦组、替米沙坦+GW9662组。采用Western Blot和RT-PCR观察大鼠脑缺血后24h时PPARγ、色素上皮源性生长因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的基因和蛋白表达变化，采用干湿法测定各组脑组织含水量，采用TTG染色法测定患侧脑梗死体积，采用改良Longna分级法评价神经功能。结果MCAO后24h，溶剂对照组PPARγ、PEDF表达明显减少，而MMP-9显著增加；替米沙坦组替米沙坦激活PPARγ能够上调PEDF、下调MMP-9，并明显改善神经功能缺失，减轻脑水肿，减小梗死体积，保护缺血脑组织；替米沙坦+GW9662组合并应用PPARγ特异性阻断剂GW9662显著逆转上述保护作用。结论PPARγ是调控脑缺血后炎症反应的关键性因子，激活PPARγ途径可能成为治疗脑缺血的新靶点。

脑缺血；过氧化物酶体增殖物激活受体；基质金属蛋白酶9

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.09.001

炎症反应是脑缺血后继发性脑损伤的最重要原因之一，早期快速有效控制炎症反应能够显著减轻脑损伤[1]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisomeprolixferator-activatedreceptorsgamma,PPARγ)是关键性核转录因子，在抗炎、抗氧化、神经保护等方面表现出独特优势，尤其是在保护缺血脑组织方面作用突出[2-3]。PPARγ能够有效调节下游炎症因子，如色素上皮源性生长因子(pigmentepithelium-derivedfactor,PEDF)和基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinases-9,MMP-9)等，抑制炎症反应。本研究选择PPARγ激动剂替米沙坦及其特异性阻断剂GW9662等干预治疗脑梗死大鼠，观察其脑水肿、脑缺血体积和神经功能缺失改善情况，探讨PPARγ保护缺血脑组织的详细机制。

1 资料与方法

1.1 动物与试剂

1.1.1 实验动物：成年雄性清洁级SD大鼠84只，体质量250～280g，由河北省实验动物中心提供。

1.1.2 试剂和仪器：兔抗PPARγ、抗PEDF多克隆抗体(美国SantaCraz)；兔抗MMP-9单克隆抗体(英国Abcam公司)；替米沙坦(德国Boehringer-Ingelheim)；GW9662(美国Sigma)；电泳仪DYY-12型(北京六一仪器厂)；多功能酶标仪Synergy-HT(美国Bio-Tek)；聚合酶链反应扩增仪(德国Eppendorf)；荧光定量PCR仪7500(美国ABI)。

1.1.3 引物设计与合成：上海生物工程公司合成，引物序列如下。PPARγ，扩增产物的DNA全长为207bp，引物序列，上游5′-GAAGACATCCCGTTCA-CAAGA-3′，下游5′-TGATGCTTTATCCCCACAGAC-3′；MMP-9，扩增产物的DNA全长为187bp，引物序列，上游5′-CAGATGATGGGAGAGAAGCAG-3′，下游5′-TGTTATGATGGTGCCACTTGA-3′；PEDF，扩增产物的DNA全长为200bp，引物序列，上游5′-CTGTGAGAGTCCCCATGATGT-3′，下游5′-AGGGG-CAGGAAGAAGATGATA-3′；β-actin，扩增产物的DNA全长为150bp，引物序列，上游5′-GGAGATTA-CTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCATCGTAC-TCCTGCTTGCTG-3′。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组和模型：随机将SD大鼠84只分为假手术组、溶剂对照组、替米沙坦组、替米沙坦+GW9662组。线栓法建立大鼠永久性右侧大脑中动脉闭塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)模型。手术前1h给予替米沙坦溶于生理盐水(30mg/kg)灌胃，并给予GW9662(4mg/kg)腹腔注射。术后24h处死，留取脑组织标本。

1.2.2 神经功能评分;处死之前，采用改良的Longa分级法单盲进行行为学评分。0分，无缺陷；1分，不能伸展对侧前肢；2分，对侧前肢屈曲；3分，轻度向对侧转圈；4分，严重向对侧转圈；5分，向对侧跌倒(n=6)。

1.2.3 测定脑组织含水量：断头取脑，冠状切开去除额极，取双侧脑组织约2mm厚，采用干湿法测定脑组织含水量，脑组织含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100% (n=8)。

1.2.4 测定脑梗死体积：断头取脑，均匀切成5片冠状切片，浸入2% 2，3，5-氧化三苯基甲氮唑溶液，37℃染色30min后4%多聚甲醛中固定24h。梗死体积(百分比)=(矫正梗死体积/非缺血侧半球体积)×100% (n=6)。

1.2.5PEDF和PPARγ蛋白和基因表达：取各实验组动物梗死侧皮层脑组织，置-80℃冻存备用。采用WesternBlot检测PPARγ、PEDF和MMP-9蛋白表达，计算PPARγ/β-actin、PEDF/β-actin和MMP-9/β-actin比值(n=4)。采用反转录-聚合酶链反应检测PPARγ、PEDF和MMP-9mRNA表达，内参基因β-actin，得到目的基因表达的CT值，与对照组相比，我们采用2-△△CT法进行相对定量分析(n=3)。

2 结 果

2.1 替米沙坦激活PPARγ改善神经功能：术后24h，假手术组行为学评分均为0分。与溶剂对照组(4.00±0.81)分和替米沙坦+GW9662组(3.76±0.68)分比较，替米沙坦组(2.40±1.32)分，神经功能障碍明显改善(F=2.482，P<0.05)；溶剂对照组与替米沙坦+GW9662组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 替米沙坦激活PPARγ显著减轻患侧脑水肿：术后24h，替米沙坦组、溶剂对照组和替米沙坦+GW9662组3组患侧脑组织有明显的水肿(P<0.05)；与溶剂对照组和替米沙坦+GW9662组比较，替米沙坦组患侧脑水肿明显减轻(P<0.05)。对侧脑组织含水量4组之间无差别，见表1。

GroupsIpsilateralContralateralSham78．22±0．3978．88±0．47Vehicle84．09±0．55∗78．11±0．30Telmisartan82．08±0．77∗#78．54±0．67Telmisartan+GW966286．04±0．69∗78．74±0．63 F2．920 P0．027

*P< 0.05vssham group #P< 0.05vsvehicle and telmisartan+GW9662 group byqtest

2.3 替米沙坦激活PPARγ显著减小脑梗死体积：与溶剂对照组(53.42±7.09)%和替米沙坦+GW9662组(44.94±7.95)%比较，替米沙坦组(35.08±3.09)%缺血性病灶体积明显减小(F=1.317，P<0.05)；替米沙坦+GW9662组与溶剂对照组比较病灶大小差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 替米沙坦激活PPARγ上调PEDF 、下调MMP-9蛋白和基因表达：Western Blot和实时定量PCR结果显示，相比假手术组，溶剂对照组和替米沙坦+GW9662组PEDF和PPARγ蛋白以及基因表达明显下降(P<0.05)，MMP-9表达明显增加(P<0.05)；替米沙坦组与溶剂对照组和替米沙坦+GW9662组比较，PEDF和PPARγ蛋白以及基因表达明显上调，MMP-9表达明显下调(P<0.05)。见表2，3和图1。

GroupsPPARγPEDFMMP⁃9Sham0．368±0．1130．904±0．5030．003±0．001Vehicle0．070±0．032∗0．121±0．062∗0．103±0．030∗Telmisartan0．284±0．084#0．842±0．470#0．042±0．023#Telmisartan+GW96620．073±0．043∗0．180±0．141∗0．081±0．011∗ F2．1982．3112．299 P0．0140．0160．031

*P< 0.05vssham group #P< 0.05vsvehicle and telmisartan+GW9662 group byqtest
PPARγ:peroxisome proliferator-activated receptor gamma;PEDF:pigment epithelium-derived factor;MMP-9:matrix metalloproteinase-9

图1 替米沙坦调节PEDF和MMP-9蛋白

Figure 1 Telmisartan regulates PEDF and MMP-9 protein by Western Blot

GroupsPPARγPEDFMMP⁃9Sham1．000±0．2511．000±0．3931．000±1．260Vehicle0．161±0．022∗0．174±0．038∗10．731±5．833∗Telmisartan0．709±0．168#0．851±0．315#2．117±1．082#Telmisartan+GW96620．210±0．143∗0．266±0．147∗9．068±1．981∗ F2．6942．8882．183 P0．0290．0180．011

*P< 0.05vssham group #P< 0.05vsvehicle and telmisartan+GW9662 group byqtest
PPARγ: peroxisome proliferator-activated receptor gamma;PEDF: pigment epithelium-derived factor;MMP-9: matrix metalloproteinase-9

3 讨 论

本研究结果显示，脑缺血早期PPARγ和PEDF 表达明显减少，MMP-9明显增多，显著的炎症反应伴有脑水肿和神经功能缺失出现；替米沙坦激活PPARγ上调PEDF、下调MMP-9水平，显著减轻脑水肿，减小脑缺血体积，改善神经功能，而PPARγ特异性阻断剂GW9662阻断了上述作用。因此，PPARγ作为上游核转录因子上调PEDF 、下调MMP-9表达，在脑缺血后炎症反应过程中发挥关键性调控作用，减轻继发性脑损伤。

PPARγ是核激素受体超家族过氧化物酶体增殖物激活受体 (peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)的3个亚型之一。作为配体依赖性的核转录因子，活化的PPARγ因在调节糖类吸收、脂肪代谢、细胞增殖和分化、免疫调节、炎症反应等机制方面作用突出而备受关注。国内外研究[2-7]发现，PPARγ还参与脑缺血后炎症反应和神经保护等过程，激活的PPARγ能够显著减小实验动物脑梗死体积，抑制脑缺血后炎症反应，促进神经保护因子的表达，减轻继发性脑损伤。研究[7-8]证明，敲除PPARγ基因，实验动物脑缺血体积显著增大。进一步证明PPARγ在脑缺血后继发性脑损伤中发挥至关重要作用。

替米沙坦是临床常用的血管紧张素受体阻断剂类抗高血压药物。近年国内外研究认定，替米沙坦是PPARγ的激活剂[9]。经过大量的实验研究证明，替米沙坦对脑缺血具有明确的保护作用，其作用不仅通过经典的肾素-血管紧张素-醛固酮途径，而且多通过依赖激活的PPARγ减轻炎症反应，显著减小脑缺血体积[2,10-11]。

本研究结果证明，PPARγ是调控脑缺血后炎症反应的关键性核转录因子，这仅仅是PPARγ复杂调控机制中的一部分，仍有大量工作需要完成。通过激活PPARγ可能成为治疗脑缺血的理想靶点。

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(本文编辑：刘斯静)

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《河北医科大学学报》编辑部

PROTECTIVEROLEOFPEROXISOMEPROLIFERATOR-ACTIVATEDRECEPTORGAMMAINRATBRAINAGAINSTFOCALCEREBRALISCHEMIA

ZHUChunhua,WENYa,WANGLina,JIHui,YANGYi,LIUYing
(DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveThisstudyistoexploreperoxisomeproliferator-activatedreceptorgamma(PPARγ)protectingratbrainagainstfocalcerebralischemicstrokeanditsmechanism.MethodsMaleSprague-Dawleyratsweresubjectedtopermanentmiddlecerebralarteryocclusion(MCAO).Sprague-Dawleyratswererandomlydividedintofourgroupssham-operatedgroup,vehiclegroup,telmisartangroup,andtelmisartan+GW9662group.At24hafterfocalcerebralischemia，theexpressionofPPARγ,pigmentepithelium-derivedfactor(PEDF),matrixmetalloproteinase-9(MMP-9)wereexploredbywesternblotandRT-PCR.Thewatercontentofbraintissuewasmeasuredbydry-wetweightmethod,theinfarctvolumewasdetectedbyTTCstain,andthenervefunctionswereevaluatedwiththeimprovedLongvamethod.ResultsAt24hafterMCAOPPARγandPEDFexpressionsignificantlydecreased,whileMMP-9increasedinvehiclegroup.TelmisartanactivatingPPARγdramaticallyup-regulatedPEDFanddown-regulatedMMP-9,alleviatedtheneurologicaldeficits,brainwatercontentandinfarctvolumeintelmisartan+GW9662group,whichwereallabolishedbyGW9662blockingPPARγasshownintelmisartan+GW9662group.ConclusionPPARγisthekeyfactorinmodulatingtheinflammatoryreactionssecondarytofocalcerebralischemia.PPARγmightbethepotentialtherapeutictargetforfocalcerebralischemia.

brainischemia;peroxisomeproliferator-activatedreceptors;matrixmetalloproteinases9

2014-04-02；

2014-07-05

祝春华(1978-)，女，河北唐山人，河北医科大学第二医院主治医师，医学博士，从事脑血管疾病诊治研究。

R743.31

A

1007-3205(2014)09-0993-04