响应面分析法优化潲水油中胆固醇的提取条件

(西华大学生物工程学院，四川 成都 610039)

当今世界餐厨废弃油脂的年产量为15亿t，而中国的产量已达到每年450万t[1]。中国目前有不少不法商贩对餐厨废弃油脂进行二次加工，炼制成潲水油销售给一些餐饮企业。当前许多经过精炼的潲水油的各项常规指标甚至能够完全达到国家标准的要求，因此区别合格食用植物油与潲水油关键就是筛选、建立有明显差异的特异性指标[2]。餐厨废弃油脂中一般混有动物油脂，动物油脂含有胆固醇，而植物油一般不含或含有极少的胆固醇[3]。由于胆固醇的极性很低，在潲水油炼制的过程中很难将其除去。张蕊等[4]和陈初良等[5]通过对胆固醇含量的测定来判别食用油中是否掺入有动物油脂作了研究。陈红等[6]选择胆固醇作为潲水油检测的特异性指标，希望能给食用植物油的安全监管以及完善食用油国家安全标准提供参考。

食用油经过皂化以后，胆固醇和甾醇作为不皂化物[7-8]可被提取出来，因此影响潲水油中胆固醇提取量的主要因素为皂化条件以及提取试剂的选择。响应面分析法的原理就是用一个多元二次回归方程拟合多因子试验中多个因子与试验结果之间的关系，估计回归方程的系数，通过对方程求极值的方法达到参数优化的目的[9]。该方法广泛应用于生产实验的优化控制中[10-11]。本实验通过单因素实验以及响应面分析法对影响胆固醇提取的因子水平及其交互作用进行优化与评价，以期最大限度地将胆固醇提取出来，并利用高效液相色谱法，将提取后的样品通过色谱柱，在设定的色谱条件下，将胆固醇和植物甾醇分离[12-13]，并定量的分析样品中胆固醇的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

潲水油由成都市质量监督局提供；玉米一级油、菜籽一级油、花生一级油均购于超市；乙醇、KOH、NaCl、石油醚、乙醚、正己烷、三氯甲烷均为分析纯；胆固醇标准品(98%)购于上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪，日本岛津；电子天平，上海精科天平有限公司；漩涡混合器，北京金紫光科技发展有限公司；TTL-DC型氮吹仪，北京同泰联科技发展有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 高效液相色谱条件[14]

分析柱：C18反相色谱柱；柱温：38 ℃；流动相：甲醇；流速：1.0 mL/min；测定波长：205 nm；进样量：10 μL。色谱图见图1。

图1 胆固醇标准品的色谱图

1.3.2 胆固醇标准曲线的绘制

称取胆固醇标准品50 mg(精确到0.1 mg)，用无水乙醇溶解定容至50 mL，溶液每毫升相当于1 mg胆固醇，放置4 ℃密封可贮藏半年。分别吸取标准贮备液0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、3.0 mL用无水乙醇定容至10 mL，配制成标准工作液。在上述色谱条件下测定标准工作液的响应值(峰面积)，以胆固醇质量浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到的线性回归方程为y=29335970.65x-20817.22，R2=0.999 8，胆固醇质量浓度在0.01～0.3 mg/mL范围内具有良好的线性关系，最低检出限为0.709 7 μg/mL。

1.3.3 样品的测定

称取200 mg的潲水油油样置于试管中，加入KOH-乙醇溶液后置于水浴锅中进行缓慢皂化。待皂化完成后取出冷却，加入提取剂以及少量NaCl(50 g/L)溶液，在漩涡混合器上充分混合3 min，待静止分层后把提取液转移到另一只试管中，重复萃取2次，合并3次提取液并用氮吹仪吹干，而后加入1 mL乙醇复溶，再用0.2 nm的滤膜过滤后置于进样瓶中进样测定。

1.3.4 单因素实验

在其他条件都相同的情况下，分别考察不同的萃取剂、皂化温度、皂化时间以及KOH-乙醇溶液的浓度对潲水油中胆固醇测定结果的影响。

1.3.5 响应面试验设计

根据前期单因素试验结果，选用正己烷为萃取剂，设定皂化温度、皂化时间、KOH-乙醇浓度这3个因素为自变量，胆固醇的提取量为响应值，进行Box-behnken设计实验，设计试验因素水平及编码值见表1。

表1 Box-Behnken设计试验因素水平及编码值

1.3.6 回收率实验

分别取100、200、300 μL质量浓度为0.1 mg/mL的胆固醇标准液，加入到合并后的萃取液中，在漩涡混合器上混匀以后进行吹干、复溶，然后过滤进样。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 不同提取剂的影响

取200 mg的油样，加入5mL 1.0 mol/L的KOH-乙醇溶液，在皂化时间60 min和皂化温度为65 ℃的条件下进行皂化，萃取剂分别选用乙醚、正己烷、三氯甲烷以及石油醚，实验结果见表2。

表2 不同萃取剂对胆固醇提取的影响

从表2可以看出，4种萃取剂对胆固醇的提取结果影响不大，三氯甲烷和石油醚的提取量稍低，乙醚和正己烷的提取量稍高，但是乙醚的沸点相对较低，且易于与乙醇互溶，故该实验中的萃取剂选用正己烷。

2.1.2 皂化温度的影响

取200 mg的油样，加入5 mL 1.0 mol/L的KOH-乙醇溶液分别在55、60、65、70、75 ℃下皂化60 min，冷却后用正己烷对胆固醇进行提取，测定结果见表3。

表3 不同皂化温度的影响

由表3的实验结果可以看出，当皂化温度不超过65 ℃时，胆固醇的提取量随温度的升高而升高，高于65 ℃后，趋于稳定。

2.1.3 皂化时间的影响

取200 mg的油样，加入5 mL 1.0 mol/L的KOH-乙醇溶液在65 ℃条件下分别皂化20、40、60、80、100、120 min，冷却后用正己烷对胆固醇进行提取，测定结果见表4。

表4 不同皂化时间的影响

随着反应时间的增长，样品的皂化度增大，但是当时间达到60 min后，胆固醇的含量略有降低。这可能是由于皂化时间的增加，皂化液的浓度[15]和黏度增高，导致皂化度的降低，将部分胆固醇重新包含，降低了胆固醇的提取量。

2.1.4 KOH-乙醇溶液浓度的影响

取200 mg的油样，分别加入5 mL 0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L的KOH-乙醇溶液，在皂化时间60 min和皂化温度为65 ℃的条件下进行皂化，冷却后用正己烷对胆固醇进行提取，测定结果见表5。

表5 不同的KOH-乙醇浓度的影响

由表5可以看出，胆固醇含量趋势在KOH-乙醇浓度为0.5～2.5 mol/L之间时成抛物线，在1.0 mol/L时，含量最高。过低或者过高的KOH-乙醇浓度都不利于油脂中胆固醇的游离，这是因为胆固醇是以胆固醇脂的形式存在于油脂中，若要使胆固醇游离出来，需要在醇碱性及加热的条件下才可打开脂键，因此乙醇量和碱量对打开油脂与胆固醇的脂键有直接影响[16]。

2.2 响应面分析及结果

Box-Behnken试验设计及结果如表6所示。

表6 Box-Behnken试验设计及结果

利用Design Expert软件对上述结果进行分析，得出胆固醇含量(Y)对皂化温度(A)、皂化时间(B)、KOH-乙醇浓度(C)的二次多项回归方程为:

Y=71.20-0.58A+1.86B-0.19C-0.47A·B+1.87A·C+0.70B·C-3A2-0.83B2-1.63C2

从表7可以看出，实验所选用模型的P值为0.000 2﹤0.01，这表明模型是显著的，不同处理之间的差异高度显著，这说明该实验方法是可靠的。

表7 回归模型的方差分析

图2 皂化时间与皂化温度对胆固醇提取量影响的等高线和响应曲面

图2显示的是当KOH-乙醇浓度水平为0，即1.0 mol/L时，皂化时间和皂化温度对胆固醇提取量的交互影响效应。由图2可知，皂化温度对胆固醇提取量的影响显著，曲线在图中表现较陡；而皂化时间对胆固醇提取量的影响不显著，曲线较为平滑。当皂化温度升高和皂化时间增长时，胆固醇的提取量逐渐增大，但是当达到一定程度时，胆固醇的提取量又开始逐渐减小。这说明皂化温度过高和皂化时间过长或者皂化温度过低和皂化时间过短都会影响胆固醇的提取量。皂化温度与KOH-乙醇浓度对胆固醇提取量影响的等高线和响应曲面如图3所示。

图3 皂化温度与KOH-乙醇浓度对胆固醇提取量影响的等高线和响应曲面

图3显示的是当皂化时间水平为0，即60 min时，皂化温度与KOH-乙醇浓度对胆固醇含量的交互影响效应。由图3可以看出，KOH-乙醇浓度对胆固醇含量的影响较为显著，表现为较陡的曲线，胆固醇的提取量随KOH-乙醇浓度的增加而增加，但达到某一特定值时，反而开始下降；而皂化温度对胆固醇提取量的影响也较为显著。这说明过高或过低的皂化温度以及KOH-乙醇浓度都会影响胆固醇的提取。皂化时间与KOH-浓度对胆固醇提取量影响的等高线和响应曲面如图4所示。

图4 皂化时间与KOH-浓度对胆固醇提取量影响的等高线和响应曲面

图4显示的是在皂化温度水平为0，即65 ℃时，皂化时间和KOH-乙醇浓度对胆固醇提取量的交互影响效应。由图可知，在一定的皂化温度条件下，KOH-乙醇浓度的增大和皂化时间的增长有助于胆固醇的提取，但是当2个因素增加到一定程度时，胆固醇的提取量又随之减小。说明KOH-乙醇浓度过高和皂化时间过长或者KOH-乙醇浓度过低和皂化时间过短都会影响胆固醇的提取。

2.3 验证试验

应用实验设计软件Design-Expert，采用响应曲面设计中的Box-Behnken设计，对皂化温度、皂化时间以及KOH-乙醇浓度这3个因素的相互作用进行探讨，确定其最佳条件为：皂化温度66.99 ℃、皂化时间59.18 min、KOH-乙醇浓度为0.89 mol/L。结合实验的可操作性，选取皂化温度67 ℃、皂化时间59 min、KOH-乙醇浓度0.9 mol/L进行验证实验，测得样品中胆固醇含量为21.139 5 mg/100g。

2.4 不同油样及回收率实验结果

用上述的最佳实验条件对不同类别的油样进行测定，得到的实验结果见表8，回收率实验见表9。

表8 不同油样的胆固醇含量

表9 回收率实验结果 mg/100 g

由实验结果可知，市面上销售的合格食用植物油中不含胆固醇，但是潲水油、火锅油以及煎炸老油中却有不同含量的胆固醇。回收率实验结果为88.57%～102.51%，平均回收率为96.03%。

3 结论

通过单因素实验以及Box—Behnken响应面法实验，确定了潲水油中胆固醇提取的最佳条件分析为：萃取剂为正己烷、皂化温度67 ℃、皂化时间59 min、KOH-乙醇浓度0.9 mol/L，在该条件下测得的潲水油样品中的胆固醇含量为21.1395 mg/100g，较优化前有很大提高。此外对其他不同的油脂中胆固醇的含量进行的测定以及回收率实验，说明该方法准确可靠。

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