连续灌注不停跳心脏移植对供心的保护作用

周涛 向道康 秦国伟

基础研究

连续灌注不停跳心脏移植对供心的保护作用

周涛 向道康 秦国伟

目的 通过建立大鼠同种异位供心停跳心脏移植模型与连续血液灌注供心不停跳心脏移植模型，探讨连续灌注不停跳心脏移植对供心的影响。方法 建立大鼠同种异位连续灌注心脏不停跳心脏移植模型（不停跳移植组）和改良Heron法建立大鼠异位心脏移植模型（停跳移植组）。移植成功后2 h检测受体外周血肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心肌肌钙蛋白I（cTnI）含量，测定供心心肌脂质过氧化终产物丙二醛（MDA）、过氧化物歧化酶（SOD）含量，电镜观察心肌结构变化，并观察心肌凋亡情况。结果 连续灌注心脏不停跳移植组受体外周血CK-MB及cTnI含量低于停跳移植组，差异有统计学意义（P<0.05）。与停跳移植组比较，不停跳移植组心肌MDA含量相对较少，SOD含量相对较多，心肌细胞凋亡指数较小，差异均有统计学意义（P<0.05）。不停跳移植组心肌线粒体等结构损伤相对较轻。结论 心脏不停跳技术能有效减轻心脏移植供心的脂质过氧化反应，保护心肌线粒体，抑制心肌细胞凋亡，可减轻心脏移植供心的再灌注损伤。

心脏移植；心肌保护；连续灌注；心脏不停跳

心脏移植业已成为各种终末期心脏病的有效治疗手段[1,2]。供心的功能状况是心脏移植手术效果的关键[3]，缺血再灌注损伤（ischemical reperfusion injury，IRI）是影响移植心脏功能状况的重要因素，因此，减轻供心的缺血再灌注损伤理论上可以改善心脏移植手术患者的预后。浅低温心脏不停跳心内直视手术的心肌保护理论不同于低温高钾心脏停跳心肌保护的传统概念，国内外较多基础和临床研究表明该技术有较理想的心肌保护效果[4,5]。同时有研究表明，基于心脏不停跳手术理论的连续灌注供心不停跳心脏移植过程中全程冠脉循环不中断，缺少再灌注损伤过程，有一定的供心保护效果[6]。本研究拟进一步讨论其保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型建立 健康雄性SD大鼠，体重250～300 g，清洁级，由广西医科大学实验动物中心提供。实验中对动物处置符合中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求。采用同系移植（供、受体均为SD大鼠），使用10%水合氯醛腹腔注射（0.3 ml/100 g体重）麻醉。160只大鼠随机分入两组：①心脏停跳移植组：供、受体各20只，建立大鼠颈部异位心脏移植模型。采用套管法将供心的无名动脉与受体右颈总动脉相接，将供心的肺动脉与受体右颈外静脉相连。②连续血液灌注不停跳心脏移植组（不停跳移植组）：供、受体各20只，替代体外循环机活体大鼠20只，献血鼠60只（替代体外循环机大鼠∶献血鼠=1∶3），建立活体大鼠替代体外循环机辅助下大鼠心脏不停跳异位心脏移植模型[6]。使用活鼠替代体外循环机，动脉供血通路和静脉输血通路取腹主动脉和下腔静脉，腹主动脉氧合血灌注给供体心脏，维持供心有节律地跳动，使用双血管套管连接法移植给受体，建立大鼠颈部不停跳心脏移植模型。各组移植后观察供心血供、心率、心律和收缩力等情况，如供心颜色红润，搏动有力，充盈适度，心率180～220次/min，各吻合口无活动性出血，则视为模型建立成功。模型成功后每组随机取15只进行下一步研究。

1.2 主要实验器械与试剂 SSW-3显微外科手术器械（上海手术器械厂），微量泵（Terumo TE-312，日本），动物呼吸机（ALC-V8，上海奥尔科特生物科技有限公司），16G和20G血管穿刺管外鞘管（BD InsyteTM，苏州碧迪医疗器械有限公司），压力延长管（深圳益心达医学新技术有限公司），7170A全自动生化分析仪（日立公司，日本），Hitachi-500型透射电镜（日立公司，日本），细胞凋亡检测试剂盒（Roche公司，德国）。

1.3 标本采集及指标检测 心脏移植术后2 h经腹主动脉采血，7170A自动生化分析仪分析受体血中心肌酶含量。采血后立即处死大鼠，取移植心脏，切取部分左室壁组织分为两部分：一部分1%锇酸固定后丙酮逐级脱水、环氧树脂包埋,超薄切片，用Hitachi-500型透射电镜观察心肌细胞特别是线粒体的结构改变；一部分10%的中性甲醛固定后常规脱水、腊块包埋，切片后使用原位末端标记（TUNEL）染色检测心肌细胞凋亡，以心肌凋亡阳性细胞数占总心肌细胞数的百分比作为细胞凋亡指数，以评价细胞凋亡的严重程度。按说明书进行操作。使用硫代巴比妥酸法测定心肌丙二醛（MDA）含量，放射免疫法测定心肌超氧化物歧化酶（SOD）含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0 for Windows软件进行统计学分析。所有计量资料以±s表示，采用方差分析或t检验，计数资料使用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组模型建立时间比较 心脏停跳移植组手术操作时间（60±15）min，冷缺血时间（16±4）min；心脏不停跳移植组手术操作时间（95±23）min，缺血时间为0，心脏不停跳移植组手术操作总时间长于心脏停跳移植组（P<0.05）。

2.2 心肌酶含量比较 心脏停跳移植组术后2 h，受体外周血心肌肌钙蛋白I（cTnI）与肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量较心脏不停跳移植组高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 两组大鼠cTnI与CK-MB含量比较（±s）

表1 两组大鼠cTnI与CK-MB含量比较（±s）

注：与心脏停跳移植组比较，aP<0.05

组别例数cTnI（ng/ml）CK-MB（U/ml）停跳移植组 15 41.38±3.24 1.49±0.13不停跳移植组 15 11.92±0.81a 0.67±0.05a

2.3 心脏移植大鼠心肌MDA、SOD含量比较 术后2 h，与心脏停跳移植组相比，心脏不停跳移植组MDA含量较少（P<0.05），SOD含量相对较高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 两组大鼠再灌注2 h时移植心肌SOD和MDA 含量比较（x±s）

2.4 心肌细胞凋亡比较 两组均有一定的心肌细胞凋亡，心脏停跳移植组凋亡指数为（40.43±5.35）%，心脏不停跳移植组凋亡指数为（16.48±2.73）%，心脏停跳移植组心肌细胞凋亡指数相对较小，阳性率明显低于心脏停跳移植组（P<0.05）。

2.5 透射电镜观察 心脏停跳移植组心肌细胞明显肿胀，染色体边集，线粒体肿胀，嵴结构紊乱模糊、部分消失，线粒体间空泡较多。心脏不停跳移植组心肌细胞及间质水肿较轻，核染色质均匀，无明显边集现象，线粒体肿胀较轻，结果相对完整。见图1、2。

图1 心脏停跳移植组心肌超微结构（×20 000）

图2 心脏不停跳移植组心肌超微结构（×20 000）

3 讨论

颈部心脏移植模型是常用的心脏移植模型[7]，其工作原理是利用Mann′s冠状循环，供体左心无射血功能，不做功，以一侧颈总动脉供应移植心脏冠脉循环[6]。本研究中两种异位心脏移植模型的基本原理相同，但模型建立过程中供心的血供状态存在差异，这也是两种动物模型的最大不同。连续血液灌注供心不停跳心脏移植是使用活体大鼠替代体外循环机模型原理，保持供心持续的血液供应。该动物模型的建立虽然存在一定的学习曲线，但掌握了移植的基本技术，模型建立的成功率较高。

目前认为，心肌缺血再灌注损伤过程实质上是一种代谢失衡，心肌能量代谢发生障碍是心肌缺血再灌注损伤的重要因素[8]。心脏移植的再灌注损伤同样与能量代谢障碍密切相关。供心缺血时，心肌组织含氧量减少，作为电子受体的氧不足，再灌注时恢复组织供氧，也提供大量电子受体，自由基短时间内爆发性增多，而自由基活性极为活泼，可以攻击生物膜磷脂中的多价不饱和脂肪酸，形成脂质自由基和引起膜脂质过氧化，同时可导致心肌细胞的凋亡。此外，由于组织缺氧，脂肪酸氧化障碍，胞质堆积的中长链脂肪酰CoA可抑制线粒体内膜腺苷转位酶的活性，线粒体氧化磷酸化过程受阻，ATP生成减少，心肌细胞能量代谢障碍加重[9]。丙二醛是氧自由基使脂质发生过氧化反应过程中的重要中间代谢产物，可反映机体脂质过氧化程度，其水平高低可间接反映机体细胞受氧自由基攻击的严重程度[10]。本实验结果显示，连续血液灌注心脏不停跳可以改善供心组织缺血再灌注时的能量代谢障碍，优化心肌细胞能量代谢，明显减少心脏移植大鼠丙二醛含量，自由基清除剂超氧化物歧化酶含量相对较高，减轻了移植心肌再灌注过程中的脂质过氧化反应。

同时，TUNEL法和电镜结果表明，有持续血液供应的心脏不停跳供心抑制了心脏移植再灌注损伤时的心肌细胞凋亡，减轻了供体线粒体等结构损害的严重程度，对供心缺血再灌注损伤有明显的保护作用。

连续血液供应心脏不停跳心脏模型操作过程中供心全程冠脉循环不中断，保持供心持续的供血，心肌得到接近生理状态的有氧代谢、酸碱和电解质代谢环境，最大程度减轻供心的再灌注损伤，因而获得良好的心肌保护效果。

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Protective effect of continuous perfusion of donor heart on rat cardiac allograft

ZHOU Tao＊，XIANG Dao-kang，QIN Guo-wei.＊Department of Cardiac Surgery，Guizhou Provincial People′s Hospital，Guiyang 550002，China

Objective To investigate the protective effect of continuous perfusion of donor heart on rat cardiac allograft in heart transplantation model.Methods To establish the rat heterotopic cardiac beating heart transplantation model（beating heart group）and modified Heron’s transplantation model（control group）.The peripheral blood CK-MB and cTnI content at 2 h after the success of the establishment of heart transplantation model were measured.The level of MDA，SOD，and myocardial structural，myocardial apoptosis were observed in two groups.Results CK-MB and cTnI levels of peripheral blood were lower in beating heart group than those in the control group（P<0.05）.Myocardial MDA concentration in beating heart group was significantly lower than that in control group，while SOD concentration was significantly higher than that in control group.The myocardial mitochondria damage in beating heart group was significantly less than those in control group，and apoptotic index of myocardial cells was also significantly lower than that in control group（P<0.05）.Conclusion The continuous perfusion of donor heart exerts myocardial protection of donor heart by reducing the lipid peroxidation，protecting myocardial mitochondria，and inhibiting myocardial apoptosis.

Heart transplantation； Myocardial protection； Continuous perfusion； Beating heart surgery

贵州省科技攻关项目（项目编号：黔科合SY［2010］3119号）

550002 贵州省贵阳市，贵州省人民医院心脏外科（周涛、向道康）；广西壮族自治区人民医院心电诊断科（秦国伟）

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.10.021

Q95-33；R654.2

A

1672-5301（2014）10-0936－03

2014-07-21）