利用分子标记辅助选择对龙特浦B米质和白叶枯病抗性的改良

韩义胜　符策强　朱红林等

摘要：以改良天丰B为低直链淀粉含量合成基因和白叶枯病抗性基因供体，以龙特浦B为受体，利用分子标记辅助选择和常规不育系选育方法，对保持系龙特浦 B的直链淀粉和白叶枯病抗性进行了改良。 改良后的龙特浦B保留了原有的大部分性状，并具有直链淀粉含量低、抗白叶枯病、株高变矮的新特性。

关键词：不育系；直链淀粉；白叶枯病；分子标记辅助选择；基因聚合；改良

中图分类号： S336；S511.03 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0069-03

收稿日期：2014-03-10

基金项目：国家水稻产业技术体系建设专项（编号：CARS-01-73）。

作者简介：韩义胜（1974—），男，湖北宣恩人，硕士，助理研究员，从事水稻种质创新研究。E-mail：hanys135@163.com。

通信作者：徐靖，女，硕士，助理研究员，主要从事植物生物技术研究。E-mail：xujing6732807@126.com。杂交水稻在我国水稻产业中占据重要的地位，其产量优势已被广泛认可；但是在产量继续大幅度提高受到空间制约的情况下，水稻种植的效益问题逐渐引起人们的重视，高产、优质、多抗的复合型水稻品种取代单一产量优势的品种已成为必然趋势。在没有重大技术突破的情况下，现代杂交水稻育种很大程度上就是亲本不断聚合优异性状的改良型育种。随着分子生物学的发展，水稻中许多优异基因已被定位，这为利用分子标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS）技术对作物遗传改良奠定了基础。近年来，MAS技术在基因转移或聚合上的应用获得了很大成功。如Huang等运用MAS技术分别将水稻白叶枯病抗性基因Xa-4、xa-5、xa-13和Xa-21聚合到同一水稻品种中，获得高抗白叶枯病的品种[1]；陈红旗等利用MAS技术将3个稻瘟病抗性基因聚合到金23B中，获得高抗稻瘟病的品种[2]。利用MAS技术将多个抗病基因聚合以培育高抗病害材料的方法，具有经济高效的特点，但是将优良品质基因和抗性基因聚合到同一品种中的研究却相对较少。

龙特浦A（简称特A）是福建省漳州市农业科学研究所选育的野败型籼型三系不育系，具有配合力强、适应性广、易于繁殖种的优点。特优系列杂交稻组合在我国许多省份曾大面积应用，仅1998 年全国推广面积就达76.71 万hm2，占杂交水稻总面积的512%[3]，但特A也有直链淀粉含量高、不抗白叶枯病等缺点，应用受到很大限制。因此，改良特A很有必要，对不育系的改良实质上就是对保持系的改良。本研究以改良天丰B（简称天丰B）为目标基因供体，龙特浦B（简称特B）为受体，利用杂交、MAS和常规不育系选育方法，对特B的米质（主要是直链淀粉含量）和白叶枯病抗性进行了改良。改良后的特B保留了原有的穗大、粒多特性，同时具有直链淀粉含量低、抗白叶枯病、株高变矮的新特性，在风雨天气频繁、白叶枯病多发的海南地区，新特B具有广泛的应用前景。

1材料与方法

1.1试验材料

受体亲本为特B，直链淀粉含量为26.5%，不抗白叶枯病。天丰B为低直链淀粉合成基因供体，直链淀粉含量为15.7%；携带广谱性白叶枯病抗性基因Xa23，抗白叶枯病。供体由广东省农业科学院水稻研究所提供，试验各世代材料均种植于海南省农业科学院永发基地，常规水肥和虫害管理；接种用白叶枯Ⅳ病菌由海南省农业科学院植保所提供。

1.2目标基因连锁标记

以与控制直链淀粉合成的Wx基因连锁的SSR标记RM190[4]和与Xa23基因连锁的标记RM206[5]为MAS标记。标记由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成，其他主要生物试剂由上海博彩生物科技有限公司合成。

1.3DNA提取和PCR扩增

DNA提取参照桑贤春等的方法[6]。20μL PCR反应总体系为：2 μL正、反引物（5 μmol/L）；0.3 μL dNTP（10 mmol/L）；0.2 μL Taq酶（5 U/μL）；2 μL 10×PCR buffer[200 mmol KCl；200 mmol/L Tris-HCl，pH值8.3；100 mmol/L （NH4）2SO4；15 mmol/L MgCl2]；2 μL DNA模板；11.5 μL ddH2O。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，35次循环；72 ℃延伸 7 min。反应完成后设15 ℃保护温度。采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染按照施勇烽等的方法[7]进行。

1.4培育新特B的方法

以特B为母本、天丰B为父本进行杂交，特B为轮回亲本。回交时，利用MAS技术并结合农艺性状表现，选取RM190和RM206标记杂合条带的单株连续回交3代，至BC3F1时自交，在BC3F2群体中，选取2个标记都为纯合条带的单株，以特A为母本，连续测保、加代。在回交转育过程中，以保持不育性和理想株型为筛选条件，选择株型紧凑、剑叶直立、株高较特B稍矮的单株为测保单株。最后通过对BC3F6各单株进行直链淀粉含量测定，以直链淀粉含量在15%～17%的单株为入选单株（图1）。

1.5白叶枯病抗性和直链淀粉含量的测定

白叶枯病抗性鉴定采用人工剪叶接种法[8]；稻米直链淀粉测定参照GB/T 15683—2008《大米直链淀粉含量的测定》进行。

2结果与分析

2.1标记分析与选择

RM190和RM206在供、受体亲本间（P1和P2）的多态性良好，能精确区分杂合和纯合基因型，适宜MAS育种。2个标记在BC3F2群体均出现3种带型（图2）。回交时，每次都选2个标记均为杂合带型的单株回交，至BC3F1，然后自交。在BC3F2群体中，首先用RM190检测，将带型为3的单株挑出，然后用RM206检测，再次将带型为3的单株挑出，此时挑出的单株已经聚合低直链淀粉合成基因和Xa23基因，且处于纯合状态。从658个BC3F2单株中选择25个农艺性状较好的单株用于回交转育和加代。通过连续6次转育、加代，并对转育材料进行米质检测、白叶枯病抗性鉴定和农艺性状优选，最终获得了2个抗白叶枯病，株型与原特B相似但株高略矮、具有不同低直链淀粉的特B改良系，分别编号为D1、D2。

2.2白叶枯病抗性鉴定

采用海南白叶枯主要生理小种Ⅳ病菌接种2个特B改良系，进行白叶枯病抗性鉴定，在分蘖结束回水期接种，20 d后调查发现，2个特B改良系病斑长度≤1.2 cm的株数占总株数的90%，全部表现为高抗，与供体天丰B抗性相似，明显强于原来的特B（表1）。

3结论与讨论

3.1稻米品质的改良

稻米品质内涵丰富，但直链淀粉一直被认为是稻米品质的核心指标之一，对蒸煮和食味品质指标，如稻米的吸水性、胀性、黏性和软硬度等有着决定性的影响[9]。低直链淀粉是优质稻米的重要指标。稻米淀粉形成机理比较复杂，栽培条件和遗传组成都对直链淀粉有较大影响[10-13]，从遗传上改良稻米直链淀粉仍是育种专家的主要研究方向。多数研究认为，直链淀粉由1对或2对主效基因控制，并受微效多基因的修饰。目前公认蜡质基因Wx是控制直链淀粉的主效基因[14]，因此寻找与Wx基因连锁的分子标记是MAS技术育种的关键环节。本研究利用RM190标记进行分子标记辅助选择，对改良特B稻米直链淀粉检测结果显示，含量均在16%左右，与供体接近。由此可见，在选育直链淀粉梯度的育种材料时，可以用标记RM190进行分子辅助选择。

3.2水稻白叶枯病抗性改良

截至 2013 年，已报道的白叶枯病抗性基因已有38 个[15]，但不同抗性基因的抗病力和抗谱却有较大差别。在目前已鉴定并定位的抗性基因中，Xa23具有抗性强、抗谱广、抗性持久、表型显性等特点[8]。本研究选择已导入Xa23基因的天丰B作为改良特B白叶枯病抗性的供体。从获得的2个改良系接种白叶枯Ⅳ病菌表现看，Xa23基因对海南白叶枯病生理小种病菌具有较好的抗性。

3.3利用MAS技术聚合多个基因的改良型育种

对于表型鉴定困难或鉴定费时费力的一些性状，MAS育种无需考虑环境条件对基因表达的影响，可以在苗期或低世代进行选择。但是，MAS技术的准确性依赖于目标基因与连锁标记的紧密程度，连锁越紧密，选择结果越可靠。因此开发与目标性状（基因）紧密连锁的分子标记是进行MAS技术育种的前提条件。随着水稻高密度遗传图谱的构建和水稻全基因组测序的完成，分子标记的开发越来越便捷高效，利用MAS技术进行有利基因的聚合育种必将成为现代育种的重要途径，特别是抗性育种[3-4]，但是将抗性基因和优良品质基因通过MAS技术聚合在同一个品种中却不多见。抗性好、质优、产量高应是筛选水稻良种的必然要求。本试验将低直链淀粉合成基因和白叶枯病抗性基因聚合在特B中，检测表明2个改良系的直链淀粉含量和白叶枯病抗性都达到了预期目标。

参考文献：

[1]Huang N，Angeles E R，Domingo J，et al. Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice：marker-assisted selection using RFLP and PCR[J]. Theoretical and Applied Genetics，1997，95（3）：313-320.

[2]陈红旗，陈宗祥，倪 深，等. 利用分子标记技术聚合3个稻瘟病基因改良金23B的稻瘟病抗性[J]. 中国水稻科学，2008，22（1）：23-27.

[3]高明亮，冯建成，王雪珍，等. 龙特浦A的利用及其改良研究[J]. 杂交水稻，2001，16（2）：5-6.

[4]万映秀，邓其明，王世全，等. 水稻Wx基因的遗传多态性及其与主要米质指标的相关性分析[J]. 中国水稻科学，2006，20（6）：603-609.

[5]罗小芬，邓椋爻，刘丕庆，等. 水稻抗白叶枯病Xa23基因的微卫星标记RM206在育种群体中的多态性分析[J]. 广西农业生物科学，2007，26（2）：120-124.

[6]桑贤春，何光华，张毅，等. 水稻PCR扩增模板的快速制备[J]. 遗传，2003，25（6）：705-707.

[7]施勇烽，应杰政，王磊，等. 鉴定水稻品种的微卫星标记筛选[J]. 中国水稻科学，2005，19（3）：195-201.

[8]章琦，赵炳宇，赵开军，等. 普通野生稻的抗水稻白叶枯病（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）新基因Xa-23（t）的鉴定和分子标记定位[J]. 作物学报，2000，26（5）：536-542.

[9]夏明元，李进波，张建华，等. 利用分子标记辅助选择技术选育具有中等直链淀粉含量的早稻品种[J]. 华中农业大学学报，2004（2）：183-186.

[10]马均，明东风，马文波，等. 不同施氮时期对水稻淀粉积累及淀粉合成相关酶类活性变化的研究[J]. 中国农业科学，2005，38（2）：290-296.

[11]于新，赵庆勇，赵春芳，等. 携带Wx-mq基因的不同类型水稻新品种（系）直链淀粉含量分析[J]. 江苏农业学报，2012，28（6）：1218-1222.

[12]石英尧，石扬娟，张志转，等. 旱作对稻米直链淀粉含量的影响研究[J]. 安徽农业科学，2006，34（17）：4253-4254.

[13]钱永德，郑桂萍，李小蕾，等. 氮镁耦合对粳稻龙粳20稻米外观品质和加工品质的影响[J]. 江苏农业科学，2013，41（7）：40-44.

[14]蔡秀玲，刘巧泉，汤述翥，等. 用于筛选直链淀粉含量为中等的籼稻品种的分子标记[J]. 植物生理与分子生物学学报，2002，28（2）：137-144.

[15]国家水稻数据中心. 基因数据分类检索[EB/OL]. （2013-07-15）[2013-09-04]. http：//www.ricedata.cn/gene/.

2.2白叶枯病抗性鉴定

采用海南白叶枯主要生理小种Ⅳ病菌接种2个特B改良系，进行白叶枯病抗性鉴定，在分蘖结束回水期接种，20 d后调查发现，2个特B改良系病斑长度≤1.2 cm的株数占总株数的90%，全部表现为高抗，与供体天丰B抗性相似，明显强于原来的特B（表1）。

3结论与讨论

3.1稻米品质的改良

稻米品质内涵丰富，但直链淀粉一直被认为是稻米品质的核心指标之一，对蒸煮和食味品质指标，如稻米的吸水性、胀性、黏性和软硬度等有着决定性的影响[9]。低直链淀粉是优质稻米的重要指标。稻米淀粉形成机理比较复杂，栽培条件和遗传组成都对直链淀粉有较大影响[10-13]，从遗传上改良稻米直链淀粉仍是育种专家的主要研究方向。多数研究认为，直链淀粉由1对或2对主效基因控制，并受微效多基因的修饰。目前公认蜡质基因Wx是控制直链淀粉的主效基因[14]，因此寻找与Wx基因连锁的分子标记是MAS技术育种的关键环节。本研究利用RM190标记进行分子标记辅助选择，对改良特B稻米直链淀粉检测结果显示，含量均在16%左右，与供体接近。由此可见，在选育直链淀粉梯度的育种材料时，可以用标记RM190进行分子辅助选择。

3.2水稻白叶枯病抗性改良

截至 2013 年，已报道的白叶枯病抗性基因已有38 个[15]，但不同抗性基因的抗病力和抗谱却有较大差别。在目前已鉴定并定位的抗性基因中，Xa23具有抗性强、抗谱广、抗性持久、表型显性等特点[8]。本研究选择已导入Xa23基因的天丰B作为改良特B白叶枯病抗性的供体。从获得的2个改良系接种白叶枯Ⅳ病菌表现看，Xa23基因对海南白叶枯病生理小种病菌具有较好的抗性。

3.3利用MAS技术聚合多个基因的改良型育种

对于表型鉴定困难或鉴定费时费力的一些性状，MAS育种无需考虑环境条件对基因表达的影响，可以在苗期或低世代进行选择。但是，MAS技术的准确性依赖于目标基因与连锁标记的紧密程度，连锁越紧密，选择结果越可靠。因此开发与目标性状（基因）紧密连锁的分子标记是进行MAS技术育种的前提条件。随着水稻高密度遗传图谱的构建和水稻全基因组测序的完成，分子标记的开发越来越便捷高效，利用MAS技术进行有利基因的聚合育种必将成为现代育种的重要途径，特别是抗性育种[3-4]，但是将抗性基因和优良品质基因通过MAS技术聚合在同一个品种中却不多见。抗性好、质优、产量高应是筛选水稻良种的必然要求。本试验将低直链淀粉合成基因和白叶枯病抗性基因聚合在特B中，检测表明2个改良系的直链淀粉含量和白叶枯病抗性都达到了预期目标。

参考文献：

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[3]高明亮，冯建成，王雪珍，等. 龙特浦A的利用及其改良研究[J]. 杂交水稻，2001，16（2）：5-6.

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[5]罗小芬，邓椋爻，刘丕庆，等. 水稻抗白叶枯病Xa23基因的微卫星标记RM206在育种群体中的多态性分析[J]. 广西农业生物科学，2007，26（2）：120-124.

[6]桑贤春，何光华，张毅，等. 水稻PCR扩增模板的快速制备[J]. 遗传，2003，25（6）：705-707.

[7]施勇烽，应杰政，王磊，等. 鉴定水稻品种的微卫星标记筛选[J]. 中国水稻科学，2005，19（3）：195-201.

[8]章琦，赵炳宇，赵开军，等. 普通野生稻的抗水稻白叶枯病（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）新基因Xa-23（t）的鉴定和分子标记定位[J]. 作物学报，2000，26（5）：536-542.

[9]夏明元，李进波，张建华，等. 利用分子标记辅助选择技术选育具有中等直链淀粉含量的早稻品种[J]. 华中农业大学学报，2004（2）：183-186.

[10]马均，明东风，马文波，等. 不同施氮时期对水稻淀粉积累及淀粉合成相关酶类活性变化的研究[J]. 中国农业科学，2005，38（2）：290-296.

[11]于新，赵庆勇，赵春芳，等. 携带Wx-mq基因的不同类型水稻新品种（系）直链淀粉含量分析[J]. 江苏农业学报，2012，28（6）：1218-1222.

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[13]钱永德，郑桂萍，李小蕾，等. 氮镁耦合对粳稻龙粳20稻米外观品质和加工品质的影响[J]. 江苏农业科学，2013，41（7）：40-44.

[14]蔡秀玲，刘巧泉，汤述翥，等. 用于筛选直链淀粉含量为中等的籼稻品种的分子标记[J]. 植物生理与分子生物学学报，2002，28（2）：137-144.

[15]国家水稻数据中心. 基因数据分类检索[EB/OL]. （2013-07-15）[2013-09-04]. http：//www.ricedata.cn/gene/.

2.2白叶枯病抗性鉴定

采用海南白叶枯主要生理小种Ⅳ病菌接种2个特B改良系，进行白叶枯病抗性鉴定，在分蘖结束回水期接种，20 d后调查发现，2个特B改良系病斑长度≤1.2 cm的株数占总株数的90%，全部表现为高抗，与供体天丰B抗性相似，明显强于原来的特B（表1）。

3结论与讨论

3.1稻米品质的改良

稻米品质内涵丰富，但直链淀粉一直被认为是稻米品质的核心指标之一，对蒸煮和食味品质指标，如稻米的吸水性、胀性、黏性和软硬度等有着决定性的影响[9]。低直链淀粉是优质稻米的重要指标。稻米淀粉形成机理比较复杂，栽培条件和遗传组成都对直链淀粉有较大影响[10-13]，从遗传上改良稻米直链淀粉仍是育种专家的主要研究方向。多数研究认为，直链淀粉由1对或2对主效基因控制，并受微效多基因的修饰。目前公认蜡质基因Wx是控制直链淀粉的主效基因[14]，因此寻找与Wx基因连锁的分子标记是MAS技术育种的关键环节。本研究利用RM190标记进行分子标记辅助选择，对改良特B稻米直链淀粉检测结果显示，含量均在16%左右，与供体接近。由此可见，在选育直链淀粉梯度的育种材料时，可以用标记RM190进行分子辅助选择。

3.2水稻白叶枯病抗性改良

截至 2013 年，已报道的白叶枯病抗性基因已有38 个[15]，但不同抗性基因的抗病力和抗谱却有较大差别。在目前已鉴定并定位的抗性基因中，Xa23具有抗性强、抗谱广、抗性持久、表型显性等特点[8]。本研究选择已导入Xa23基因的天丰B作为改良特B白叶枯病抗性的供体。从获得的2个改良系接种白叶枯Ⅳ病菌表现看，Xa23基因对海南白叶枯病生理小种病菌具有较好的抗性。

3.3利用MAS技术聚合多个基因的改良型育种

对于表型鉴定困难或鉴定费时费力的一些性状，MAS育种无需考虑环境条件对基因表达的影响，可以在苗期或低世代进行选择。但是，MAS技术的准确性依赖于目标基因与连锁标记的紧密程度，连锁越紧密，选择结果越可靠。因此开发与目标性状（基因）紧密连锁的分子标记是进行MAS技术育种的前提条件。随着水稻高密度遗传图谱的构建和水稻全基因组测序的完成，分子标记的开发越来越便捷高效，利用MAS技术进行有利基因的聚合育种必将成为现代育种的重要途径，特别是抗性育种[3-4]，但是将抗性基因和优良品质基因通过MAS技术聚合在同一个品种中却不多见。抗性好、质优、产量高应是筛选水稻良种的必然要求。本试验将低直链淀粉合成基因和白叶枯病抗性基因聚合在特B中，检测表明2个改良系的直链淀粉含量和白叶枯病抗性都达到了预期目标。

参考文献：

[1]Huang N，Angeles E R，Domingo J，et al. Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice：marker-assisted selection using RFLP and PCR[J]. Theoretical and Applied Genetics，1997，95（3）：313-320.

[2]陈红旗，陈宗祥，倪 深，等. 利用分子标记技术聚合3个稻瘟病基因改良金23B的稻瘟病抗性[J]. 中国水稻科学，2008，22（1）：23-27.

[3]高明亮，冯建成，王雪珍，等. 龙特浦A的利用及其改良研究[J]. 杂交水稻，2001，16（2）：5-6.

[4]万映秀，邓其明，王世全，等. 水稻Wx基因的遗传多态性及其与主要米质指标的相关性分析[J]. 中国水稻科学，2006，20（6）：603-609.

[5]罗小芬，邓椋爻，刘丕庆，等. 水稻抗白叶枯病Xa23基因的微卫星标记RM206在育种群体中的多态性分析[J]. 广西农业生物科学，2007，26（2）：120-124.

[6]桑贤春，何光华，张毅，等. 水稻PCR扩增模板的快速制备[J]. 遗传，2003，25（6）：705-707.

[7]施勇烽，应杰政，王磊，等. 鉴定水稻品种的微卫星标记筛选[J]. 中国水稻科学，2005，19（3）：195-201.

[8]章琦，赵炳宇，赵开军，等. 普通野生稻的抗水稻白叶枯病（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）新基因Xa-23（t）的鉴定和分子标记定位[J]. 作物学报，2000，26（5）：536-542.

[9]夏明元，李进波，张建华，等. 利用分子标记辅助选择技术选育具有中等直链淀粉含量的早稻品种[J]. 华中农业大学学报，2004（2）：183-186.

[10]马均，明东风，马文波，等. 不同施氮时期对水稻淀粉积累及淀粉合成相关酶类活性变化的研究[J]. 中国农业科学，2005，38（2）：290-296.

[11]于新，赵庆勇，赵春芳，等. 携带Wx-mq基因的不同类型水稻新品种（系）直链淀粉含量分析[J]. 江苏农业学报，2012，28（6）：1218-1222.

[12]石英尧，石扬娟，张志转，等. 旱作对稻米直链淀粉含量的影响研究[J]. 安徽农业科学，2006，34（17）：4253-4254.

[13]钱永德，郑桂萍，李小蕾，等. 氮镁耦合对粳稻龙粳20稻米外观品质和加工品质的影响[J]. 江苏农业科学，2013，41（7）：40-44.

[14]蔡秀玲，刘巧泉，汤述翥，等. 用于筛选直链淀粉含量为中等的籼稻品种的分子标记[J]. 植物生理与分子生物学学报，2002，28（2）：137-144.

[15]国家水稻数据中心. 基因数据分类检索[EB/OL]. （2013-07-15）[2013-09-04]. http：//www.ricedata.cn/gene/.