几种金属离子对胭脂红与牛血清白蛋白相互作用的影响——荧光光谱研究

李建晴，刘 冷，李改仙

(晋中学院 化学化工学院，山西 晋中 030600)

几种金属离子对胭脂红与牛血清白蛋白相互作用的影响
——荧光光谱研究

李建晴*，刘 冷，李改仙

(晋中学院 化学化工学院，山西 晋中 030600)

利用荧光光谱法研究了不同温度(15、27、39 ℃)下食用合成色素胭脂红对牛血清白蛋白(BSA)的内源荧光猝灭特性，考察了Cu2+、Ni2+、Pb2+等金属离子对二者相互作用的影响，并测定了不同温度下的猝灭常数KSV、结合常数KA和结合位点数n. 结果表明，3种金属离子基本不影响胭脂红对BSA荧光猝灭机理，但Cu2+、Ni2+、Pb2+离子都与BSA有一定的结合能力，可在不同程度上增强胭脂红与BSA的结合作用及其对BSA内源荧光的猝灭.

Cu2+；Ni2+；Pb2+；胭脂红；牛血清白蛋白；相互作用；荧光光谱

蛋白质是生物体内最重要的物质之一，人和动物体内防御疾病，抵抗外界病源体入侵的抗体等都是蛋白质. 进行蛋白质的定量测定，研究蛋白质与其他物质的相互作用对研究蛋白质的结构性质具有十分重要的意义[1-2]. 食用合成色素胭脂红[3](Ponceau 4R)，又名丽春红4R、红亮猩红等,是目前我国使用最广泛，用量最大的一种单偶氮类人工合成色素，其分子式为C20H9O10N2S3Na3，结构见图1. 国标GB2760-86[4]规定，胭脂红可用于果味水、汽水、罐头、浓缩果汁等.

光谱法是研究生物大分子，特别是蛋白质与各种小分子作用的重要手段[5-6]. 本文作者应用荧光光谱法在研究Ponceau 4R对牛血清白蛋白(BSA)荧光猝灭的基础上，对人体中微量元素Cu(II)以及可能存在的有害金属Pb(II)和Ni(II)，在不同温度下与Ponceau 4R-BSA结合的竟争作用进行了研究，同时考察了三种金属离子存在时对Ponceau 4R-BSA的结合常数KA，结合位点数n等的影响，为色素研究、重金属元素的中毒与解毒机理研究提供了一些实验基础和一定的理论依据.

图1 胭脂红的结构Fig.1 The structure of Ponceau 4R

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CARY Eclipse荧光分光光度计(自带恒温装置)(美国VARIAN公司)；pHS-2ST数显酸度计(上海天达仪器有限公司).

胭脂红(天津多福源实业有限公司)，用以配制1.0×10-3mol/L的储备液；牛血清白蛋白(BSA)(上海伯奥生物科技有限公司)，用以配制1.0×10-4mol/L的储备溶液；Britton-Robison(B-R)缓冲溶液；分别配制1.0×10-2mol/L CuCl2、Ni(NO3)2、Pb(NO3)2的储备液，使用时适当稀释. 实验用水为亚沸二次蒸馏水，其余药品均为分析纯.

1.2 实验方法

10 mL比色管中依次加入1.0 mL BSA储备液，1.0 mL1.0×10-4mol/L的Cu2+、Ni2+、Pb2+储备液，不同量胭脂红储备液，2.0 mL pH=7.4的B-R缓冲溶液，然后定容，放置30 min. 在λex=280 nm,λem=350 nm处，1 cm比色皿，激发和发射狭缝均为5 nm，扫描荧光光谱.

2 结果与讨论

2.1 Cu2+、Ni2+、Pb2+存在下Ponceau 4R对BSA荧光的猝灭光谱

在pH=7.4下，依据实验方法研究了Ponceau 4R与BSA相互作用的荧光光谱如图2所示. 由图可见，随着Ponceau 4R浓度的增加，BSA的荧光逐步被猝灭.

相同实验条件下做了Cu2+存在下Ponceau 4R与BSA相互作用的荧光光谱如图3所示，Ni2+存在下Ponceau 4R与BSA相互作用的荧光光谱如图4所示，以及Pb2+存在下Ponceau 4R与BSA相互作用的荧光光谱如图5所示.

cBSA=0.1 μmol/L, 1→7: cPonceau 4R=0,2,4,6,8,10,14 μmol/L

cBSA=0.1 μmol/L, cCu2+=0.1 μmol/L,1→7: cPonceau 4R=0,2,4,6,8,10,14 μmol/L

实验发现，总体来讲，Cu2+、Ni2+和Pb2+的加入使胭脂红加强了对BSA内源荧光的猝灭程度，但是BSA的荧光发射峰形变化不大，发射峰的位置λem也没有显著移动. 由此可见，金属离子不同程度的参与了胭脂红和BSA的结合反应[7].

2.2 Cu2+、Ni2+、Pb2+存在下Ponceau 4R与BSA的结合常数KA、结合位点数n

实验测定了在15、27、39 ℃三个温度下以及Cu2+、Ni2+和Pb2+存在时，Ponceau 4R对BSA荧光的猝灭光谱. 根据Stern-Volmer猝灭方程[8-9]，F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]，作出Cu2+、Ni2+、Pb2+存在时，Ponceau 4R对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer曲线(图6)，并且求得三种金属离子存在时，Ponceau 4R对BSA荧光的猝灭常数KSV. 由分子荧光的平均寿命τ0=10-8s，Ksv=Kqτ0，可计算各体系对BSA荧光猝灭过程的速率常数Kq[10]. 根据lg((F0-F)/F)=lgKA+nlg [Q]，求得不同温度下Cu2+、Ni2+、Pb2+存在时Ponceau 4R和BSA的结合常数KA、结合位点数n，其结果列于表1.

cBSA=0.1 μmol/L, cNi2+=0.1 μmol/L,1→7: cPonceau 4R=0,2,4,6,8,10,14 μmol/L

cBSA=0.1 μmol/L, cPb2+=0.1 μmol/L,1→7: cPonceau 4R=0,2,4,6,8,10,14 μmol/L

表1 胭脂红与BSA的结合常数KA,结合位点数n和猝灭常数KSVTable 1 The binding constant KA, number of binding sites and quench constants of Ponceau 4R and BSA

■： Pb2+ ×：Cu2+ ◆：Ni2+ ▲：Ponceau 4R

从图6和表1的猝灭常数Ksv可以看到，Cu2+、Ni2+、Pb2+的加入，对Ponceau 4R-BSA体系的荧光猝灭类型没有影响，猝灭过程的速率常数大于探针与荧光体作用的最大扩散常数Kq(2.0×1010L·mol-1·s-1)[8]. 随着温度升高Ponceau 4R与BSA猝灭曲线的斜率减小，仍然属静态猝灭[8]. 其猝灭常数Ksv的大小为：Ponceau 4R-Pb2+>Ponceau 4R-Cu2+>Ponceau 4R-Ni2+> Ponceau 4R. 三种金属离子的存在均加强了Ponceau 4R 对BSA荧光的猝灭作用，由此可见金属离子参与了Ponceau 4R与BSA的结合过程.

另外，从表1的数据可以看到，由于Pb2+、Cu2+、Ni2+的加入，温度对Ponceau 4R与BSA的结合常数的影响略有不同. 三个温度下，Pb2+存在时，均使Ponceau 4R与BSA的结合常数KA增大；Cu2+和Ni2+存在时，Ponceau 4R与BSA的结合常数KA在15 ℃时减小，27和39 ℃时增大.

3 结论

实验结果表明，Cu2+、Ni2+和Pb2+离子与BSA有一定的结合能力，加强了Ponceau 4R对BSA的荧光的猝灭作用. 由于各种金属离子与BSA的结合部位不同，结合力也有差别. 金属离子的存在会影响色素与白蛋白的结合能力，即影响色素与白蛋白的结合常数. 如果金属离子的存在能使色素与白蛋白的结合能力增强，会使色素更好的被存储、运载，这样色素在血浆中储留的时间将延长，可以达到缓释的目的，从而减小色素的毒性. 同时，通过研究金属离子存在下染料与蛋白的结合，也有助于理解金属离子的生理学意义与金属离子的中毒与解毒作用.

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Abstract: Pt-Pd bimetallic nanospheres supported on graphene (GR) nanosheets were prepared by a facile surfactant-free method. Namely, pre-nucleated Pd seeds were obtainedviathe redox reaction between Na2PdCl4and graphene oxide (GO). Resultant Pd seeds were then allowed to induce the growth of Pt nanoparticles (NPs) affording Pt-Pd bimetallic nanospheres. The structure of as-synthesized Pt-Pd/GR catalyst was characterized by scanning electron microscopy, transmission electron microscopy and X-ray powder diffraction, and its electrocalalytic performace towards the oxidation of methanol was evaluated. Results indicate that as-synthesized Pt-Pd/GR catalyst exhibits high catalytic activity and long-term stability towards the methanol oxidation reaction, and it provides a specific current density of 51.8 mA·cm-2for methanol oxidation.

Keywords: graphene nanosheet; supported Pt-Pd nanosphere; methanol oxidation; electrocatalyst

Effectsofseveralmetalionsontheinteractionsbetween
Ponceau4Randbovineserumalbumin
——fluorescencespectroscopicstudy

LI Jianqing*, LIU Leng, LI Gaixian

(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,JinzhongCollege,Jinzhong030600,Shanxi,China)

Fluorescence spectroscopic method was adopted to study the quenching characteristics of endogenous fluorescence of bovine serum albumin (BSA) by synthetic food pigment Ponceau 4R at different temperatures (15, 27 and 39 ℃), and the effects of metal ions Cu2+, Ni2+and Pb2+on the interactions between BSA and Ponceau 4R were investigated. Moreover, the quenching constantKSV, binding constantKA, and binding site n under different temperatures were measured. Results indicate that the three kinds of metal ion almost have no effect on the fluorescence quenching mechanism of BSA by Ponceau 4R. However, Cu2+, Ni2+and Pb2+are in some way able to combine with BSA, thereby enhancing the interactions between BSA and Ponceau 4R as well as the quenching of the endogenous fluorescence of BSA.

Cu2+; Ni2+; Pb2+; Ponceau 4R; bovine serum albumin; interaction; fluorescence spectrometry

Platinum-palladiumbimetallicnanospheressupportedongraphene
nanosheetsasenhancedelectrocatalystformethanoloxidation

YANG Zijuan, ZHAO Mengxi, CHEN Sen, FAN Yang*

(CollegeofChemistryandChemicalEngineering,XinyangNormalUniversity,Xinyang464000,Henan,China)

O 646.542DocumentcodeAArticleID1008-1011(2014)03-0273-07

2013-12-03.

国家自然科学基金 (21175086)，山西省高校科技研究开发资助项目(20111026)，山西省高校“131”领军人才工程资助项目.

李建晴(1963-)，女，教授，研究方向为分子光谱分析的研究.*

，E-mail: jq1963@126.com.

O 657.39

A

1008-1011(2014)03-0269-04