银屑病患者血清IL-26蛋白和全血Th17细胞因子mRNA表达水平的测定

韦利强，秦东春，徐武生

1河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院检验科 郑州 450052 3)郑州大学第一附属医院皮肤科 郑州 450052

银屑病患者血清IL-26蛋白和全血Th17细胞因子mRNA表达水平的测定

韦利强1)，秦东春2)#，徐武生3)

1河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院检验科 郑州 450052 3)郑州大学第一附属医院皮肤科 郑州 450052

#通讯作者，男，1963年12月生，博士，主任技师，研究方向：肿瘤与分子免疫学，E-mail:qindongchun@zzu.edu.cn

IL-26；Th17细胞；皮损面积和严重程度指数；银屑病

银屑病是一种慢性、反复发作的自身免疫性皮肤病，其确切的病因不明，与基因、激素、环境和感染因素有关。银屑病病变组织可见大量活化的T细胞、异常增殖的角质形成细胞和浸润性白细胞[1]。研究[2]发现浸润的T细胞和角质形成细胞以及其分泌的细胞因子在疾病的发生中扮演重要的角色。在病变皮肤组织中可见大量Th1细胞分泌的细胞因子如TNF-α、IFN-γ和IL-1β，所以一直认为Th1细胞在银屑病中起主导作用。近年来发现一种新的T细胞亚群Th17细胞，其可合成IL-17和IL-22。IL-17和IL-22可参与银屑病的发病过程，是银屑病发生中重要的炎症细胞因子。除了可以分泌IL-17和IL-22之外，Th17细胞还可合成IL-26[3]。该研究测定银屑病患者血清IL-26蛋白水平，分析IL-26水平与银屑病严重程度的关系，同时检测不同类型银屑病患者全血中Th17细胞因子(IL-17A、IL-22和IL-26)mRNA的表达水平，报道如下。

1 对象与方法

1.1研究对象入选病例为郑州大学第一附属医院2012年12月至2013年5月皮肤科住院部收治的加重期银屑病患者47例，其中男19例，女28例；寻常型15例，脓疱型12例，红皮型11例，关节型9例。所有银屑病患者均由2名以上副主任及以上技术职称医师确诊。患者近2周内未外用糖皮质激素、维生素衍生物、他克莫司等药物，2周内未行光线疗法或光化学疗法治疗，1个月内未口服维酸类、糖皮质激素及免疫抑制剂等药物，无系统性红斑狼疮等其他免疫性皮肤病及重要脏器器质性病变，采血前检查血常规、肝功能、肾功能均无异常。健康对照组为郑州大学第一附属医院体检中心的47例健康体检者，采集血样前1个月内无感染情况，既往无银屑病、血管炎等免疫相关性皮肤病病史。该研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会的审查并获得批准同意。每位研究对象(包括病例与对照)在正式参加研究前均必须签署知情同意书，方可为正式研究对象，确保了该研究符合赫尔辛基伦理原则要求。银屑病组年龄(33.5±16.9)岁，患病时间(4.6±3.6) a，皮损面积和严重程度指数(PASI)为(12.12±3.02)。健康对照组年龄、性别与银屑病组相匹配。

1.2主要试剂和仪器IL-26 ELISA检测试剂盒(美国BD公司)、RNAiso Plus(日本TaKaRa公司)、SuperQuickRT MasterMix 反转录试剂盒和UltraSYBR Mixture(北京康为世纪公司)、实时荧光定量PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)、酶标仪(美国Bio-RAD公司)、实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)、台式高速冷冻离心机(美国Heal Force公司)。

1.3 2组血清IL-26蛋白的测定采集静脉血2 mL，EDTA-K3抗凝，混匀。2组血清IL-26水平用IL-26 ELISA检测试剂盒测定，严格按照说明书进行操作。IL-26 ELISA检测试剂盒的测定范围为8～1 000 ng/L。用酶标仪测定A值，测定波长为450 mm。

1.4 2组全血Th17细胞因子mRNA表达水平的测定

1.4.1 总RNA提取 吸取全血100 μL，与RNAiso Plus 200 μL一起置于1.8 mL离心管中，加入氯仿，混匀，室温静置5 min， 于4 ℃ 12 000g离心15 min。吸取上清液至另一个1.8 mL离心管中，加入异丙醇，充分混匀，室温放置10 min后， 于4 ℃ 12 000g离心10 min。弃去上清，缓慢沿管壁加入体积分数75%乙醇750 μL，于4 ℃ 12 000g离心5 min。弃去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5 min。加入无RNA酶的去离子水完全溶解RNA沉淀后，溶解液置于紫外分光光度仪中进行测定，读取260与280 nm的A值，利用A(260 nm)/A(280 nm)比值估计核酸的纯度，A(260 nm)/A(280 nm)比值控制在1.8～2.0。

1.4.2 RNA样本反转录 利用SuperQuickRT MasterMix进行RNA反转录。按照试剂盒提供的反应体系进行反转录反应。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。-20 ℃保存。

1.4.3 实时荧光定量PCR 利用UltraSYBR Mixture对目的基因进行扩增，总反应体积为50 μL。实时荧光定量PCR引物的正义链和反义链分别如下。β-actin：5’-TGAGATGGCCTCAGGTGGTA-3’，5’-CGGGCAGGCAGAATAGAGAC-3’；IL-17A：5’-AGAGATATCCCTCTGTGATC-3’，5’-TACCCCAAAGTTATCTCAGG-3’；IL-22，5’-ACAGCAAATCCAGTTCTCCAA-3’，5’-TC CAGAGGAATGTGCAAAAG-3’；IL-26：5’-GGCAGAAATTGAGCCACTGT-3’，5’-TCCAGTTCACTGATGGCTTTG-3’。PCR反应条件：预变性，95 ℃ 10 min；然后95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，60 ℃延伸1 min，共40个循环；溶解曲线分析，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。以β-actin作为内参，结果以2-ΔCt表示，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(内参)。

1.5统计学处理采用SPSS 19.0对数据进行分析。所有连续性变量均符合正态分布，方差齐同。银屑病组和健康对照组之间血清IL-26蛋白水平和IL-17A、L-22、IL-26 mRNA表达水平的比较采用两独立样本的t检验；银屑病患者血清IL-26水平与PASI的相关性采用Pearson相关分析；不同类型银屑病患者间全血IL-17A、IL-22、IL-26 mRNA表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1银屑病组和健康对照组血清IL-26蛋白水平及全血IL-17A、IL-22、IL-26mRNA的表达水平与健康对照组比较，银屑病组血清IL-26蛋白水平升高，差异有统计学意义；同时银屑病组全血IL-17A、IL-22和IL-26 mRNA表达水平亦升高，差异有统计学意义。见表1。

2.2银屑病患者血清IL-26蛋白水平与疾病严重程度的相关性银屑病患者血清IL-26蛋白水平与PASI呈正相关(r=0.684,P<0.001)。

2.3不同类型银屑病患者全血IL-17A、IL-22、IL-26mRNA表达水平见表2。不同类型银屑病患者全血IL-17A和IL-22 mRNA 表达水平差异无统计学意义。但IL-26 mRNA表达水平在不同类型银屑病患者间差异有统计学意义；且与寻常型、脓疱型和红皮型患者比较关节型患者IL-26 mRNA表达水平升高，而寻常型、脓疱型、红皮型患者间差异无统计学意义。

表1 银屑病组和健康对照组血清IL-26蛋白水平及全血IL-17A、IL-22、IL-26 mRNA表达水平的比较

表2 不同类型银屑病患者全血IL-17A、IL-22、IL-26 mRNA表达水平

*:与关节型组比较，P<0.05。

3 讨论

该研究发现银屑病患者血清IL-26蛋白水平升高，并与疾病的严重程度呈正相关。目前关于IL-26生物学功能的报道不多。Dambacher等[4]报道Crohn病患者血清中IL-26水平升高，并能诱导肠上皮细胞分泌TNF-α和IL-8。最近，Corvaisier等[5]发现IL-26在类风湿性关节炎患者的血清和关节腔积液中均升高，并能促进单个核细胞产生IL-8、TNF-α等细胞因子。IL-26在银屑病中的作用机制仍然不清楚。IL-26受体(IL-20R1和IL-10R2)表达于皮肤角质形成细胞表面，并能诱导其产生IL-8[6]。这可能是IL-26参与银屑病发病过程的一种机制。

同时作者分析了不同类型银屑病患者全血Th17细胞因子mRNA表达情况，发现IL-17A和IL-22 mRNA表达水平在不同类型银屑病患者间差异无统计学意义，关节型银屑病患者全血中IL-26 mRNA表达水平高于其他类型银屑病患者。这可能是由于除了Th17细胞分泌IL-26，关节型银屑病患者病变关节腔的滑膜细胞也可以分泌IL-26[5]。银屑病患者病变组织中的IL-17A与IL-22均升高[7]，这与作者发现的银屑病患者全血中IL-17A、IL-22和IL-26 mRNA表达水平升高是一致的。目前对IL-17和IL-22的生物学功能已有深入研究，但是IL-26的生物学功能仍不清。IL-17又包括IL-17A、IL-17E和IL-17F等，其中以IL-17A为主。IL-17A能激活NF-κB和MAPK信号途径，引起多种效应，主要效应为诱导中性粒细胞的活化和聚集，同时还能抑制炎症组织的中性粒细胞凋亡。IL-17A还可以通过刺激血管生成素和基质金属酶产生，从而促进组织的血管生成和修复。除此之外，IL-17A还能与TNF-α起协同作用，促进IL-6、IL-1β和TNF-α释放，加剧炎症进程。但是，IL-17A不能刺激角质形成细胞的增殖[8]。IL-22也是Th17细胞产生的重要炎症细胞因子。与IL-17A不同，IL-22能促进角质形成细胞的增殖。IL-22能够刺激角质形成细胞分泌抗微生物氨基酸肽，同时也能促进角质形成细胞分泌基质金属酶，并且银屑病病变组织和血浆中IL-22的含量与疾病严重程度相关[9]。鉴于IL-22与IL-26拥有一定相似的氨基酸序列，都属于IL-10细胞因子家族，且二者均可由Th17细胞产生，IL-26是否具有与IL-22相似的生物学功能有待于进一步的研究。

虽然该研究证实了IL-26水平在银屑病患者中升高，且在关节型银屑病患者中高于其他类型的银屑病患者，并与疾病的严重程度呈正相关；提示IL-26可成为银屑病，尤其是关节型银屑病诊断及治疗、监测的辅助指标。但是该研究仍有不足之处，如样本量偏少，未对IL-26在银屑病中的发病机制进行深入的研究。所以IL-26要成为关节型银屑病的临床辅助诊断指标以及新的治疗靶点，仍需要扩大样本量，同时进行动物实验研究，以进一步揭示IL-26在银屑病发病机制中的确切作用。

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(2013-10-11收稿 责任编辑姜春霞)

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.044