巨噬细胞移动抑制因子对血管平滑肌细胞胶原代谢信号转导的影响

章 玲, 李 军, 麦爱欢, 梁新剑

(广东省深圳市人民医院 心内科, 广东 深圳, 518000)

巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是由Bloom和Benett等[1]最先在活化的T淋巴细胞中发现的一种可溶性的细胞因子，该因子在体外能抑制巨噬细胞的自由移动，并能引起巨噬细胞在Ⅳ型超敏反应中的聚集。MIF与胶原蛋白的关系密切，研究[2]发现MIF可以促进体外培养的血管平滑肌细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达，能够促进平滑肌细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致胶原增生传导通路已经基本明确，本研究探讨MIF致胶原增生信号传导通路与AngⅡ致胶原增生传导通路的差异，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SD大鼠4只，雌雄不限(中山医科大学动物中心提供)。DMEM细胞培养液；小牛血清；分析纯AngⅡ、MIF(Sigma公司产品)；兔抗鼠MIF抗体；总ERK、ERK抗体; PD 98059。PTC-200PCR仪; MSE微量离心机；凝胶成像系统；超净工作台；水平摇床；紫外分光光度计; CS台式低温离心机；台式低温离心机；生化培养箱。细胞培养用设备。

1.2 实验方法

将原代大鼠主动脉平滑肌细胞分为5组，每组6个样本，以传代细胞培养法调整细胞密度为1×106/mL。接种于六孔板中，先采用无血清DMEM液饥饿培养24 h后，换用含药物的10%小牛血清的DMEM液继续培养。各组加入药物具体如下: ① 第1组仅加入含10%小牛血清的DMEM液继续培养5、10、20、40、60 min, 作对照组; ② 第2组加入终浓度为100 ng/mL的MIF继续培养5、10、20、40、60 min, 作为MIF刺激组; ③ 第3组加入终浓度为10～6 mol/L的AngⅡ继续培养5、10、20、40、60 min, 作为AngⅡ刺激组; ④ 第4组加入终浓度为100 ng/mL的MIF和50 μmol/L的PD 98059继续培养5、10、20、40、60 min, 作为MIF+PD 98059作用组(PD 98059先加入1 h后再加MIF); ⑤ 第5组加入终浓度为10～6 mol/L的AngⅡ和50 μmol/L的PD 98059继续培养5、10、20、40、60 min, 作为AngⅡ+PD 98059作用组(PD 98059先加入1 h后再加AngⅡ)。收集蛋白质并采用Western-blotting法测定磷酸化ERK、总ERK。

1.3 统计学处理

2 结 果

line 1: MIF作用后平滑肌细胞ρ-ERK表达; line 2: AngⅡ作用后平滑肌细胞ρ-ERK表达; line 3: MIF+PD98059作用后平滑肌细胞ρ-ERK表达; line 4: AngⅡ+PD98059作用后平滑肌细胞ρ-ERK表达; line 5: 对照组作用后平滑肌细胞ρ-ERK表达; line 6: 对照组作用后平滑肌细胞总ERK表达。

MIF、AngⅡ、MIF+ PD 98059、AngⅡ+ PD 98059刺激平滑肌细胞生长，测定磷酸化ERK、总ERK蛋白表达。Western blotting表明，在44KDa处有明显的阳性条带，可以确定有磷酸化ERK、总ERK蛋白表达。见图1。

以Molecular Analyst软件进行磷酸化ERK灰度值与总ERK蛋白灰度值比较半定量分析，二者的比值代表磷酸化ERK相对含量，测定结果表明，MIF、AngⅡ刺激平滑肌细胞, 5 min时AngⅡ刺激组平滑肌细胞磷酸化ERK相对含量升高，与对照组比较，差别有统计学意义(P<0.05); 40 min时磷酸化ERK相对含量达到最高值, 60 min时有所下降。而MIF刺激组20 min时磷酸化ERK升高，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05); 60 min时仍保持较高水平。加用PD 98059后，与各时点未加PD 98059的MIF、AngⅡ组比较，平滑肌细胞ERK磷酸化水平均下降(P<0.05)。见表1。

表1 不同药物刺激平滑肌细胞各时点磷酸化ERK相对含量

3 讨 论

MIF是一种多功能细胞因子,与胶原蛋白的关系十分密切。胶原在动脉硬化的形成中起到重要的作用，动脉粥样硬化斑块中存在MIF的过度表达[3-4]。通过MIF中和抗体和反义核酸技术阻断MIF的表达则可以使斑块趋于稳定[5]。前期研究表明MIF蛋白可以促进平滑肌细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达增多，可以促进平滑肌细胞合成胶原蛋白，但MIF促进胶原合成的信号转导途径却少有研究报道。

胶原增生有其经典的传导通路[6]: AngⅡ+AT1R→MAPK/ERK活性增加→C-fos增加→AP1增加→TGF-β增加→胶原增生。MAPK/ERK是其中关键环节，ERK是所有MAPKs家族成员中最早被认识，而且是最具特征性的[7]。ERK信号转导通路的大致模式为：多种生长因子→Ras→Raf→MEK1/2ERK→有丝分裂、分化[8-9]。应用丝裂原激活蛋白激酶/胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)通路高效选择性抑制剂(PD 98059)能阻止AngⅡ促前胶原合成作用, PD 98059如果能够阻止MIF促进胶原合成的信号转导途径，则可以推测MIF促进胶原合成也经过MAPK/ERK这个关键环节。Leng等[10]研究发现,MIF可能通过与细胞膜表面蛋白CD74的细胞外基团结合而发挥作用,激活胞内的丝裂原激活蛋白激酶家族的细胞外信号调节激酶MAPK/ERK信号转导途径,从而引起各种细胞的增生及炎性介质的合成与释放,产生各种生理效应。实验中发现，无论AngⅡ还是MIF均可以使磷酸化ERK增多，使用PD 98059可以看到AngⅡ和MIF引起平滑肌细胞磷酸化ERK水平增高的作用被明显抑制，说明AngⅡ和MIF均可以激活MAPK/ERK途径，提示MIF对平滑肌细胞胶原的合成作用可能与AngⅡ致胶原增生信号转导途径关键环节是一样的。实验中还观察到, AngⅡ作用于平滑肌细胞, 5 min即可出现磷酸化ERK水平增高, 40 min达到高峰, 60 min后磷酸化ERK水平开始下降，这与以前的文献报道[7]相似，而MIF作用于平滑肌细胞, 20 min后才见到细胞磷酸化ERK升高，60 min仍在较高水平, MIF组致细胞磷酸化ERK出现的时间和峰值较AngⅡ作用于平滑肌细胞后出现的时间和峰值晚。Lue等[11]研究发现, MIF可通过瞬时(30 min以内)和持续(24 min以上)磷酸化激活ERK/MAPK信号转导途径两种方式而发挥重要生物学作用。Kleemann等[12]利用荧光受体和凝胶电泳分析证实内源性和外源性MIF能够抑制Jab1诱导的AP1转录活性,表明MIF可以通过Jab1-AP1途径发挥生物学作用。MIF促进胶原合成不排除还有其他途径可能，需要进一步的研究。

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