茶多酚对人结肠癌细胞株Caco-2凋亡及RhoA蛋白活性的影响

董丽华, 朱 旭, 姜仕柱, 李琪毅

(1. 三峡大学仁和医院 消化内科, 湖北 宜昌, 443001; 2. 重庆市渝北区人民医院 外二科, 重庆, 401120)

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其早期确诊率不高，被发现时大多已经出现肝、肺、骨等全身转移。手术切除是治疗结肠癌的主要方法，但术后约70%的患者远期生存率不高。结肠癌细胞株Caco-2在结肠癌组织中表达较高，且具有较的强转移能力[1]。研究[2]报道，RhoA蛋白活性增强可以促进肿瘤转移的发生。茶多酚是茶叶的主要成分，具有很强的抗氧化功能和调控致癌因子，对肿瘤形成的各个阶段都有预防和抑制作用[3]。本实验通过探讨茶多酚对人结肠癌细胞株Caco-2凋亡及RhoA蛋白活性的影响，以期为结肠癌的早期诊断及治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人结肠癌细胞株Caco-2(美国ATCC公司)，98%的茶多酚(湖南绿蔓生物科技有限公司)，DMEM血清及四甲基偶氮唑蓝(MTT)(上海实生细胞生物技术有限公司)，碘化丙啶(南京大治生物科技有限公司)，DMEM培养基及胰蛋白酶(Gibco公司)，RhoA活性测定试剂盒(Cytoskeleton公司)，凝胶电泳仪(美国Bio-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 人结肠癌细胞株Caco-2培养与分组：取出冻存的人结肠癌细胞株Caco-2细胞，快速解冻，加入DMEM培养基，取对数生长期的Caco-2细胞，加入磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，胰蛋白酶消化。混匀后离心，悬浮后移入培养瓶，台盼蓝染色细胞计数，接种后常规培养。培养至对数生长期再传代后，分为实验组和对照组。实验组分4组，分别加入浓度为25、50、100及200 μmol/L的茶多酚，对照组加入等体积的RPMI-1640培养液，分别培养12、24、36、48及72 h后检测。

1.2.2 形态学观察：光镜及HE镜下观察生长状态良好的细胞和加入茶多酚后细胞的不同形态。

1.2.3 MTT法测定不同浓度茶多酚在不同作用时间对结肠癌细胞株Caco-2增殖的影响：取对数生长期细胞，以1×104/mL的密度接种于96孔培养板，移入恒温细胞培养箱中，使其贴壁生长，分别用不同浓度的茶多酚(25、50、100和200 μmol/L)处理细胞12、24、36、48及72 h。上机前4 h培养板每孔加入MTT 20 μL, 然后弃去孔内液体，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，终止培养；选择490～570 nm波长处，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值并记录结果。以不同时间为横坐标，以(1-实验组光吸收值/对照组光吸收值)作为纵坐标，绘制肿瘤细胞的生长抑制曲线，计算细胞增殖抑制率(IR), IR=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.2.4 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡指数：将Caco-2细胞培养于6孔板，加入10%小牛血清和DMEM高糖培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。孵育24 h后加入茶多酚，浓度分别为25、50、100及200 μmol/L; 另设对照组。加药48 h后，细胞作FCM样品制备，分别收集各组细胞，用预冷的70%乙醇固定24 h; 检测前细胞悬液用0.01 mmoL PBS洗涤2次，弃上清液；细胞沉淀中加入150 μL RNA酶A(0.1 mg/mL), 重悬细胞, 4 ℃避光孵育30 min；再加入120 μL PI染液至终浓度为0.1 mg/mL, 混匀, 4 ℃避光孵育10 min; 将细胞悬液混匀，用200目尼龙膜过滤细胞到流式细胞管，以去除细胞团块，上机检测。

1.2.5 人结肠癌Caco-2 DNA的提取：取对数期生长的Caco-2细胞，以1×104/mL密度接种于6孔板中培养，24 h后分别加入等量生理盐水和25、50、100及200 μmol/L浓度的茶多酚溶液，培养24 h后离心，加入200 μL细胞裂解液，重悬细胞后至浓度为100 μg/mL。60 ℃水浴4 h后，离心，取上清液，加入酚：氯仿：异戊醇500 μL；再离心，取上清液，加入2倍体积无水酒精，混匀，出现白色絮状物即为DNA，离心、沉淀、溶解于无菌纯水中，备用。

1.2.6 琼脂糖凝胶电泳：取10 μL备用的Caco-2 DNA，加入6×上样缓冲液，混匀后加到新鲜配制的2%琼脂糖凝胶点样孔中，在90 V/h电压中电泳、拍照。

1.2.7 RhoA活性测定：采用Pull-down方法，按照RhoA活性测定试剂盒说明，按1∶500抗RhoA抗体应用Wsetern blot方法检测5组不同处理Caco-2细胞的总RhoA及RhoA蛋白。

2 结 果

2.1 不同浓度茶多酚在不同作用时间对结肠癌细胞株Caco-2增殖的影响

分别培养12、24、36、48和72 h后，50、100及200 μmol/L浓度组的细胞增殖活A值明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05); 25 μmol/L浓度组在培养24 h后细胞增殖活A值亦明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05), 说明茶多酚对Caco-2细胞有抑制作用，且随着药物浓度的升高，对Caco-2细胞增殖抑制作用逐渐增强，见表1; 不同浓度组细胞生长抑制率随着时间的延长有升高趋势，见图1。

表1 不同浓度茶多酚在不同作用时间对结肠癌细胞株Caco-2增殖的影响

与对照组比较，*P<0.05。

图1 不同浓度组细胞生长抑制率随时间的变化

2.2 FCM检测细胞凋亡指数

Caco-2细胞与茶多酚共同孵育24 h后，随着药物浓度的增加，细胞凋亡指数亦增高。25、50、100和200 μmol/L浓度组的细胞凋亡指数分别为(26.31±1.49)%、(45.22±1.32)%、(66.14±1.62)%和(75.32±1.64)%, 均明显高于对照组(5.12±1.15)%(P<0.01)。

2.3 茶多酚对人结肠癌Caco-2细胞DNA的影响

提取人结肠癌Caco-2细胞DNA, 进行琼脂凝胶电泳，由于细胞凋亡程度不同，因此在电泳时凋亡细胞的DNA条带表现呈弥散状分布及梯状条带，被认为是典型的凋亡指标，说明茶多酚能促进人结肠癌细胞株Caco-2的凋亡，且随着浓度的增加对细胞生长抑制增加(图2)。

DNA电泳条带从左到右依次为DNA Marker、25、50、100及200 μmol/L

2.4 RhoA蛋白活性检测结果

各组细胞均在相对分子质量为30 000处可见1条与RhoA相符的清晰条带，每组细胞均包括RhoA蛋白及活性RhoA蛋白2个条带，各组间RhoA总蛋白表达无差别，但与对照组比较，其活性RhoA蛋白水平下调。通过对总RhoA表达量来校正，以活性RhoA与总RhoA比值进行分析，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

1. 对照组; 2. 25 μmol/L组; 3. 50 μmol/L组; 4. 100 μmol/L组; 5. 200 μmol/L组; A. 活性RhoA蛋白; T. 总RhoA蛋白

3 讨 论

茶多酚具有抗氧化、清除自由基、调节致癌因子及抑制肿瘤血管生成等作用，能够预防和治疗多种肿瘤[4]，但其抗癌机制尚不明确。Wang等[5]研究发现，茶多酚可显著降低荷瘤小鼠血清丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，提示茶多酚可通过增强体内抗氧化酶的活性、抑制脂质过氧化反应而产生抗癌作用。Caco-2细胞来源于人结肠癌上皮细胞，能分化形成具有小肠上皮细胞微绒毛结构，表达多种蛋白载体和酶，在结肠癌转移的组织中，其表达增高，并且在转移的过程中，发挥着重要的作用。Li等[6]研究表明，抑制结肠癌细胞株Caco-2活性，促进其凋亡，可抑制结肠癌细胞的转移。Shimizu等[7]研究表明，茶多酚复合体及主要儿茶素单体对氧自由基的消除率达98%以上，在一定范围内呈量效关系。徐静等[8]研究表明，结肠癌细胞株Caco-2凋亡，与诱导剂(熊去鹅胆酸)浓度及时间呈正向相关性。Singh等[9]对茶多酚通过Fas相关死亡域蛋白(FADD)依赖方式介导细胞凋亡进行了实验研究，发现不同浓度的茶多酚能诱导 DNA 片段化，并与剂量相关；高浓度的茶多酚(>800 mg/mL)能够导致肿瘤细胞凋亡和细胞溶解。

本实验发现，茶多酚和Caco-2细胞共孵育12 h后，50、100和200 μmol/L浓度组的细胞增殖活A值分别为(0.1052±0.0192)、(0.0975±0.0154)和(0.0912±0.0134), 明显低于对照组(0.01239±0.0154); 25 μmol/L浓度组在培养24 h后比较，细胞增殖活A值为(0.1072±0.0124), 亦明显低于对照组(0.1236±0.0146); 随着作用时间的延长，各药物浓度组细胞增殖活性呈降低趋势，说明茶多酚能有效抑制结肠癌细胞Caco-2增殖，且具有时间和浓度依赖性。

GU等[10]研究发现，结肠癌中RhoA活性增加与肿瘤淋巴结转移有关。RhoA属于Rho家族蛋白的Rho亚家族成员，与Ras蛋白相同，是重要的细胞内信号分子，可通过多种信号途径参与调节细胞的生长、凋亡和细胞周期。Yang等[11]通过RNAi技术沉默RhoA的表达，抑制体内结肠直肠癌细胞的生长。Wang等[12]研究表明, RhoA可以调节多种转录因子的活性，是改变细胞骨架组装，调控细胞迁移，参与肿瘤转移的关键因子，同时还可促进肿瘤血管的生成。王德盛等[13]应用siRNA于血管内皮细胞，发现RhoA在mRNA和蛋白水平均下调，凋亡细胞上升4倍，内皮细胞生长被强烈抑制，且内皮细胞的迁移能力被抑制，并有剂量依赖效应，内皮细胞的乳头状腔管形成能力也下降。此外，大量体外研究[14-16]发现，RhoA参与肿瘤细胞的黏附、收缩和移动、黏附结合的解除、基质的降解及对血管和淋巴脉管系统侵入等过程的调控，涉及肿瘤侵袭和转移的各个环节中。本实验中提取人结肠癌Caco-2 细胞DNA, 进行琼脂凝胶电泳，结果显示凋亡的Caco-2细胞DNA条带表现呈弥散状分布及梯状条带，进一步行RhoA蛋白活性检测，结果显示浓度组间RhoA总蛋白表达无差别，但与对照组比较，其活性RhoA蛋白水平下调，提示通过利用茶多酚抑制Caco-2细胞中RhoA表达，可以抑制肿瘤细胞的生长、增殖，促进肿瘤细胞凋亡。

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