人卵巢黄素化颗粒细胞bcl-2蛋白及mRNA的表达与卵巢反应性的关系

赵志明 郝桂敏 周亮 朱序理 王跃

·论著·

人卵巢黄素化颗粒细胞bcl-2蛋白及mRNA的表达与卵巢反应性的关系

赵志明 郝桂敏 周亮 朱序理 王跃

目的探讨体外受精-胚胎移植中人卵巢黄素化颗粒细胞凋亡相关基因bcl-2蛋白和mRNA的表达与相应卵巢反应性的关系。方法收集行体外受精-胚胎移植患者卵泡液中的黄素化颗粒细胞28例，根据卵泡数不同进行卵巢反应性分组分为低反应组、中反应组和高反应组；免疫细胞化学方法检测颗粒细胞bcl-2蛋白表达；RT-PCR测定颗粒细胞bcl-2 mRNA表达。分析人黄素化颗粒细胞bcl-2蛋白及mRNA表达与卵巢反应性的关系。结果分离提纯的人黄素化颗粒细胞于24 h内贴壁生长良好。免疫细胞化学结果显示，随着获卵数的增加bcl-2蛋白HSCORE评分(以下简称HSCbcl-2)逐渐上升，HSCbcl-2与获卵数呈正相关(P<0.01)。高反应组、中反应组和低反应组HSCbcl-2差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果显示，bcl-2 mRNA表达与年龄呈负相关(P<0.01)，而与获卵数呈正相关(P<0.05)。高反应组、中反应组和低反应组bcl-2 mRNA表达有统计学差异(P<0.05)。结论凋亡相关基因bcl-2蛋白及mRNA的表达与卵巢反应性有明显的相关性。

体外受精；卵巢反应性；颗粒细胞；B细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因

卵巢颗粒细胞合成和分泌雌激素和孕激素，有高度分裂增殖的潜能。在卵泡发育的不同阶段，颗粒细胞增殖速度不同，当卵母细胞发育成熟并接近卵泡壁时，颗粒细胞分裂能力最强，对卵泡的形成和发育起重要作用[1]。体外受精(in vitro fertilization,IVF)中获取的颗粒细胞，来自于成熟卵泡，即黄素化颗粒细胞，其功能状态反映了此时颗粒细胞的功能[2]。本研究通过测定IVF中获取的人卵巢黄素化颗粒细胞凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B-cell lymphoma/leukemia-2,bc1-2) mRNA及蛋白表达，比较bcl-2表达的变化，力图探索它们对卵巢反应性的影响，探讨与凋亡相关基因bcl-2与卵巢生殖功能的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 人卵巢黄素化颗粒细胞标本，取于2007年11月到2008年2月在河北医科大学第二医院生殖医学科行IVF治疗的不孕症患者28例，月经周期正常，不孕原因为双侧输卵管梗阻或男性不育。年龄23～37岁，平均(31±5)岁，基础体温呈双向型，血清泌乳素水平在正常范围，受试前3个月内均未服用过激素类药物。促排卵方案采用长周期降调节方案，常规促性腺激素(gonadotrophin,Gn)刺激卵泡发育，阴道B超和尿排卵试纸半定量法监测卵泡发育，适时肌注人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)5 000～10 000 U，34～36 h后阴道超声引导下穿刺取卵。取卵日B超监测下经阴道后穹窿穿刺取卵。取卵后第2或第3天行宫腔内胚胎移植术，移植后14 d测定尿妊娠试验阳性，移植后4周B超检查宫腔内可见孕囊，为临床妊娠。记录每位患者使用Gn用量、获卵数等。分离出卵丘复合物后的卵泡液及颗粒细胞经患者夫妇同意用于科研用途。

1.2 分组原则 根据取卵时卵泡发育数不同进行卵巢反应性分组，卵泡直径为16 mm以上的卵泡数≤4个为卵巢低反应组(低反应组)，卵泡数5～19个为卵巢中反应组(中反应组)，≥20个为卵巢高反应组(高反应组)。

1.3 人黄素化颗粒细胞的分离和培养 颗粒细胞取自河北医科大学第二医院生殖医学科行IVF女性的卵泡穿刺液，每例分离出卵子后的卵泡液离心后的细胞沉淀物经密度梯度法提取颗粒细胞，经胰蛋白酶消化后，经胎盘蓝染色细胞存活率在85%～90%，将活颗粒细胞浓度调整为2×105/ml的单细胞悬液备用。采用盖玻片培养法，37℃、5% CO2培养箱培养，24 h后，细胞贴壁达到80%以上，经固定、干燥，用于免疫细胞化学测定。

1.4 免疫细胞化学bcl-2蛋白表达 使用1∶100兔抗人bcl-2多克隆抗体(一抗)和生物素化第二抗体，DAB显色、复染、脱水、封片，光镜观察并照相。Bcl-2定位于胞浆。免疫细胞化学结果判定采用组织化学评分(histochemistry score,HSCORE)法[3]。排除爬片边缘的细胞，瞬时针盲法选取10个细胞分布均匀的视野，每个视野下计数50个细胞。阳性染色为细胞内出现棕黄色颗粒，以i代表染色深浅，根据细胞着色的强弱分为4个等级：无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。HSCORE=Σpi(i+1)(i=0，1，2，3；Pi表示评分为i的比例)。该评分法考虑到了单个细胞是否阳性及其强弱，更客观地反映细胞蛋白的表达情况。

1.5 RT-PCR测定bcl-2mRNA表达 采用Trizol一步法提取总RNA。从NCBI-Nucleotide数据库中查找目的基因原始cDNA序列，采用primer 5.0软件设计扩增引物，PCR引物序列如下：β-actin引物扩增产物135 bp。上游引物: 5’-CCAACTGGGACGACAT-3’，下游引物:5’-TCTGGGTCATCTTCTCG-3’。 Bcl-2引物扩增产物351 bp。上游引物:5’-CCAGATGGCAAATGACC-3’，下游引物: 5’-TGGCAGGATAGCAGCAC-3’。反应体系25 μl，包括逆转录产物2 μl，各检测指标上下游引物各1 μl，dNTP(2 mmol/L)2.5 μl，10×PCR反应缓冲液2.5 μl，Red Tag DNA聚合酶1 μl，双蒸水16 μl。设定反应条件：96℃预变性5 min，95℃变性30 s，β-actin、Bcl-2退火温度分别为53℃、51.5℃，时间分别为35 s、40 s，72℃延伸30 s，β-actin、bcl-2分别为30、40个循环后，72℃延伸10 min。PCR产物4℃保存。取25 μl扩增产物，在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳(120 V，40 min)，0.05 μl/ml Goldview染色，读胶仪读取扩增条带的光密度值并进行分析、照相。采用目的基因/内参的比值表示目的基因 mRNA 表达水平。

2 结果

2.1 人黄素化颗粒细胞在体外培养生长情况 分离提纯的人黄素化颗粒细胞培养显示，细胞于24 h内贴壁生长良好，倒置显微镜下观察细胞，见细胞主要呈星形或椭圆形生长，细胞有细长的突起，相互连接，细胞核大，圆，胞浆饱满富含颗粒。

2.2 人黄素化颗粒细胞bcl-2蛋白表达 随着患者的年龄、Gn量的增加，bcl-2蛋白HSCORE评分(以下简称HSCbcl-2)逐渐降低，随着获卵数的增加HSCbcl-2逐渐上升，但bcl-2蛋白表达与年龄、Gn量的相关性无统计学意义(r=-0.3388,P>0.05;r=-0.3417,P>0.05)，而与获卵数呈正相关(r=0.6183,P<0.01)。随着卵巢反应性的增高，bcl-2蛋白表达逐渐升高；3组比较，高反应组、中反应组和低反应组bcl-2蛋白表达差异有统计学意义(F=5.2058,P<0.05)；两两比较，高反应组与中反应组和低反应组之间均差异有统计学意义(q=3.3635,P<0.05;q=4.778,P<0.05)，而中反应组和高反应组间差异无统计学意义(q=1.3461,P>0.05)。见表1，图1。

2.3 人黄素化颗粒细胞bcl-2 mRNA表达 随着患者的年龄、Gn量的增加，bcl-2 mRNA表达逐渐降低，随着获卵数的增加bcl-2 mRNA表达逐渐上升；bcl-2 mRNA表达与年龄呈负相关(r=-0.5667,P<0.01)，与Gn量无统计学相关性(r=-0.2914,P>0.05)，而与获卵数呈正相关(r=0.4584,P<0.05)。随着卵巢反应性的增高，bcl-2 mRNA表达逐渐升高；高反应组、中反应组和低反应组bcl-2 mRNA表达差异有统计学意义(F=3.5653，P<0.05)；高反应组与低反应组之间差异有统计学意义(q=3.7756,P<0.05)，而中反应组和高反应组、低反应组间均差异无统计学意义(q=2.3026，P>0.05;q=2.500，P>0.05)。见表1，图2。

表1不同反应组bcl-2蛋白表达(HSCOREbcl-2)和mRNA表达的比较

组别bcl-2蛋白表达(HSCOREbcl-2)bcl-2mRNA表达高反应组(n=5)2.7260±0.36000.8673±0.2141中反应组(n=19)2.2316±0.4119*0.6724±0.2392低反应组(n=4)1.8475±0.4885*0.4409±0.2605*

注：与高反应组比较,*P<0.05

高反应组 中反应组 低反应组

图2 不同反应组黄素化颗粒细胞bcl-2mRNA的表达

3 讨论

3.1 颗粒细胞凋亡对女性生殖的调节作用 颗粒细胞对卵泡的形成和发育，及卵母细胞的营养和成熟起重要作用。动物实验提示：闭锁卵泡中存在大量的凋亡颗粒细胞，而健康卵泡中凋亡颗粒细胞则很少[2]。卵泡颗粒细胞首先凋亡，诱导卵母细胞凋亡，触发了卵泡闭锁。IVF卵泡液中获取的颗粒细胞，来自于成熟卵泡，即黄素化颗粒细胞。而对体外受精促排卵过程中获得的黄素化颗粒细胞进行体外培养，则是获得人颗粒细胞并对其进行系统研究的较好实验方法[3]。

3.2 bcl-2基因和相关蛋白与凋亡 Bc1-2是研究较广泛的一种细胞凋亡信号基因，bcl-2蛋白可表达于正常细胞的激活和发育过程中，走向凋亡的细胞中低表达或不表达。作为细胞内重要的凋亡抑制蛋白，bcl-2基因高表达可明显维持细胞的存活[4]。Bcl-2基因对于卵泡细胞凋亡的调控也具有重要作用。在卵泡闭锁过程中，bcl-2蛋白参与了颗粒细胞凋亡的调节，能抑制GC凋亡，促进卵泡的生长和排卵[5]。当颗粒细胞凋亡导致卵泡闭锁时，在颗粒细胞内几乎检测不到凋亡抑制基因的表达产物bc1-2蛋白[6]。高浓度的bcl-2蛋白可以干扰细胞内质网中Ca2+的释放，进而抑制细胞凋亡，另外，bcl-2能阻止脂质过氧化物的形成，抑制氧化诱导的细胞凋亡，bcl-2的抗氧化作用和抑制自由基产生，可能是其阻止细胞凋亡的另一机制[7]。

3.3 bcl-2基因和相关蛋白与卵巢反应性 Bcl-2是研究较广泛的一种细胞凋亡信号基因，表达在人卵巢组织中。在卵泡发育过程中，Bcl-2可抑制卵泡膜细胞及颗粒细胞的凋亡，促进其分泌雌、孕激素，促进卵泡的生长和排卵，进而控制卵母细胞凋亡，延缓卵泡闭锁[8]。在卵泡闭锁过程中，bcl-2参与了颗粒细胞凋亡的调节。动物实验表明，当颗粒细胞凋亡导致卵泡闭锁时，在颗粒细胞内几乎检测不到凋亡抑制基因的表达产物bc1-2蛋白[9]。卵巢颗粒细胞中特异表达bcl-2的转基因小鼠与普通小鼠比较，其排卵数和窝产仔数明显升高；而卵巢中剔除bc1-2基因的小鼠，其功能卵泡数目减少，并且没有卵母细胞的卵泡发生[10]。本研究中bcl-2蛋白随着卵巢反应性的升高而表达上调，说明卵巢反应性与卵泡的颗粒细胞的凋亡增加有关，bcl-2参与了卵巢颗粒细胞的凋亡过程，且在颗粒细胞对卵泡发育过程中可能发挥了重要的作用。

总之，凋亡可能是卵母细胞退化形成的潜在机制，bcl-2家族可能在卵泡发育中扮演一个关键作用，这些发现可能对提高IVF和相关技术提供了一个重要启示。

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Studyontherelationshipbetweentheexpressionofapoptosis-relatedbcl-2proteinaswellasmRNAofluteinedgranulosacellsandovarianreactivity

ZHAOZhiming,HAOGuimin,ZHOULiang,etal.DepartmentofReproductiveMedicine,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

ObjectiveTo investigate the correlation between the expression of apoptosis-related bcl-2 bcl-2 protein as wellas mRNA of human luteined granulosa cells (GCs) and ovarian reactivity.MethodsTwenty-eight infertility cases receiving IVF-ET were enrolled in the study.The experiment was divided into three groups according to ovarian follicle number,low reactivity group,median reactivity group and high reactivity group.The expression of bcl-2 protein of GCs was detected by immunocytochemistry; expression of bcl-2 mRNA of GCs was detected by RT-PCR.Finally the correlation between the expression of apoptosis-related bcl-2 protein as well as mRNA of human luteined granulosa cells (GCs) and ovarian reactivity was analyzed.ResultsThe isolated and purified GCs were cultured and adhered well within 24 hours.Immuocytochemistry examination showed that the HSCORE scoring of bcl-2 protein (HSCbcl-2) was gradually increased with the increase of number of retrieved oocytes,and HSCbcl-2 was positively correlated to number of retrieved oocytes (P<0.01).There were significant differences in HSCbcl-2 of GCs among the three groups (P<0.05).RT-PCR showed that the expression of bcl-2 mRNA of GCs was negatively related with subject’s age (P<0.01),however,which was positively correlated to the number of retrieved oocytes (P<0.05).There were significant differences in the expression levels of bcl-2 mRNA of GCs among the three groups (P<0.05).ConclusionThe expression of apoptosis-related bcl-2 protein and mRNA of luteined granulosa cells is closely correlated to ovarian reactivity.

in vitro fertilization; ovarian response; granulosa cells; B-cell lymphoma/leukemia-2

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.10.003

项目来源：河北省科学技术研究与发展支撑计划(编号：10276105D-88)

050000 石家庄市，河北医科大学第二医院生殖医学科

R 714.1

A

1002-7386(2014)10-1451-03

2013-12-17)