吴茱萸碱抑制涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞侵袭的实验研究

陈彪 屈鹏飞 贾志宇 李晓玲 杨威 张英怀

·论著·

吴茱萸碱抑制涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞侵袭的实验研究

陈彪 屈鹏飞 贾志宇 李晓玲 杨威 张英怀

目的研究吴茱萸碱对涎腺腺样囊性癌 ACC-M 细胞侵袭的影响。方法用终浓度为0、 0.01、 0.1、 1、 10、 100 μg/ml的吴茱萸碱处理 ACC-M细胞2、4、6、8、10 h后，应用transwell小室侵袭实验检测和观察ACC-M细胞的侵袭抑制情况。结果吴茱萸碱处理组较对照组穿过上室底面膜的细胞数少，细胞数随浓度增大，时间增长基本呈递减趋势，侵袭抑制率随浓度的增大而增大，随时间的增长而增大，侵袭抑制率最高可达59.99%。结论吴茱萸碱可以抑制涎腺腺样囊性癌 ACC-M细胞侵袭。

吴茱萸碱；涎腺腺样囊性癌；侵袭

涎腺腺样囊性癌是最常见的恶性肿瘤之一，浸润性极强和易发生远处转移是腺样囊性癌的重要特征，因此术后复发率高，生存率也比较低[1]。目前具有抗肿瘤活性的植物有效成分受到了极大关注[2]，吴茱萸碱(evodiamine)就是其中之一,研究表明，吴茱萸碱可以诱导涎腺腺样囊性癌细胞凋亡并抑制细胞增殖[3]。但是，吴茱萸碱是否能抑制涎腺腺样囊性癌细胞的侵袭，国内外尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料 人涎腺腺样囊性癌细胞系 ACC-M 由上海交通大学口腔颌面外科实验室提供。采用 RPMI 1640 培养基加入10% 胎牛血清和抗生素，于37℃、5% CO2恒温箱内饱和湿度培养，24～48 h传1 代，以0．04%二乙胺四乙酸二钠(EDTA)和0.25%胰蛋白酶混合液消化传代。吴茱萸碱购自中国药品生物制品检定所，纯度≥98%。用二甲基亚砜配制成100 mg/ml的储存液，储存于-20℃冰箱中。使用前用培养液稀释，培养液中加入等量二甲基亚砜作为对照组。Matrigel基质胶，购自美国BD公司(货号356234)。Transwell小室，购自美国康宁公司(货号3422)。肝细胞生长因子(HGF)，PROSPEC产品(货号CYT-244)。

1.2 方法

1.2.1 transwell小室侵袭实验：每一个transwell小室上室膜的底面预先铺好Matrigel基质胶 50 μl(将50 μl的微量加样器末端剪去后逐个加入)；下室内加入含有肝细胞生长因子(HGF)(化学趋化物)的细胞培养液200 μl(30 μg/200 ml)；取对数生长期(即是细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究的时期)的细胞，用10%的细胞培养液制成单细胞悬液20 ml，其内共有细胞数为1.8×107个。在每个transwell小室的上室分别加入含有 2×105个分别用0 μg/ml(空白对照)，0.01 μg/ml，0.1 μg/ml，1 μg/ml，10 μg/ml，100 μg/ml的吴茱萸碱处理(37℃，20 min)的ACC-M细胞混匀液200 μl，37℃，5%CO2的条件下孵育；共5组，每组3个副孔；反应2、4、6、8、10 h后，在相应的时间，将相应的实验组小室上室面微孔膜上的细胞用棉签擦去(注意保护下室面膜上细胞不受影响)，10%甲醛溶液固定30 min后行Wright-Giemsa染色。

1.2.2 细胞计数：将小室由培养板中取出，将上室底部的整个膜以“井”字划分为9格，在400×镜下观察，在中心格随机选一个视野，膜周边格随机选四个格，各选一个视野，计数5个视野穿过微孔膜的细胞总数。每组4个样本。侵袭抑制率公式如下：(对照小室穿膜细胞数均值-处理小室穿膜细胞数均值)/对照小室穿膜细胞数均值×100%。

1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，使用Mauchly的球形度检验(P=0.141>0.01)，得出数据满足协方差矩阵球对称的条件，不需对结果进行校正。而后进行主体内效应检验，检验时间组合浓度组之间是否存在交互作用；使用Kruskal-Wallis 检验分别检验5个时间组间和5个浓度组间以及时间组和浓度组之间是否存在差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本实验应用Matrigel基质胶，模拟体外侵袭模型中的细胞外基质(ECM)的作用，观察吴茱萸碱对人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞系侵袭能力的影响。与对照组比较，各处理组的穿膜细胞数随着药物浓度的增加而减少，随着时间的增长而减少；根据穿膜细胞数计算出侵袭抑制率，侵袭抑制率呈现随着药物浓度的增高，时间的增长而增大的趋势；在10 h，100 μg/ml时侵袭抑制率可达59.99%。经统计学分析，不同药物浓度组之间差异有统计学意义(F=7.245，P<0.05)，即穿膜数细胞和药物浓度之间为依赖关系，随着药物浓度的增加，穿膜细胞数减少，侵袭抑制率增大；但不同时间组之间差异无统计学意义(F=7.050，P>0.05),即时间组和侵袭抑制率之间无依赖关系可循；时间组与浓度组之间不存在交互作用(F=1.426，P>0.05)。见表1、图1。

表1 各吴茱萸碱处理组穿膜细胞数

表1 各吴茱萸碱处理组穿膜细胞数

组别2h4h6h8h10h0μg/ml组217.7±8.0224.3±6.1225.3±9.4226.7±10.0231.7±15.60.01μg/ml组171.7±4.5162.3±6.5159.0±4.0153.7±3.1148.3±4.50.1μg/ml组160.3±3.1158.0±6.6153.3±3.5150.0±6.0140.0±13.01μg/ml组155.3±11.9147.0±5.3144.0±5.0140.7±9.1134.0±11.510μg/ml组139.3±1.5134.7±5.8130.3±9.0129.7±9.4114.7±3.2100μg/ml组126.7±7.0123.7±6.1115.3±6.0106.3±17.692.7±5.7

图1 不同时间组和浓度组的侵袭抑制率

3 讨论

传统医学认为吴茱萸有温中散寒，疏肝止痛之功效，常用于脘腹冷痛，呕吐腹泻，头痛胃痛和痛经等。近代医学证明吴茱萸有镇痛，安神，抗菌，降压等药理作用[4]。目前，国内外对于吴茱萸碱抗肿瘤作用的研究较少。Ogasawara等[5-7]研究了吴茱萸碱对结肠癌细胞26-L5，Lewis肺癌细胞LLC和恶性黑色素瘤细胞 B16-F10的作用，发现吴茱萸碱可通过浓度依赖方式抑制结肠癌细胞26-L5的侵袭，在10 mg/ml浓度时可达到70%的抑制。用10 mg/ml浓度吴茱萸碱处理过的LLC 和26-L5肿瘤细胞接种于裸鼠体内后，可显著降低肺转移和肝转移。其中吴茱萸碱处理过的26-L5细胞肺转移减少了70%。接种26-L5细胞后第6天开始应用吴茱萸碱的裸鼠，与对照组相比，肺内肿瘤结节的数目减少48%。吴茱萸碱以浓度依赖方式抑制肿瘤细胞的侵袭与转移，在30 mmol/L浓度时对3种细胞系均达到完全抑制[5-7]。近来研究表明吴茱萸碱对舌鳞状细胞癌Tca-8113 细胞有明显的放射增敏作用，并能改变 Tca-8113 细胞的黏附和迁移能力[8]。这些结果表明，吴茱萸碱可用于抗肿瘤侵袭和转移的治疗。

本研究用 Matrigel基质胶观察细胞侵袭力，在体外模拟肿瘤细胞侵袭的过程。结果显示经过不同浓度的吴茱萸碱处理过的 ACC-M 细胞与对照组相比，其细胞的侵袭穿膜率受到抑制，侵袭抑制率随着药物浓度的增加和时间的增长而增大；在10 h，100 μg/ml时侵袭抑制率可达59.99%；经统计学分析，不同的浓度组之间存在差别(P<0.01)，吴茱萸碱对人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞系侵袭力的影响和其本身的药物浓度呈依赖关系，在一定的药物浓度范围内，浓度越高抑制作用越明显；而时间对于细胞抑制率的影响经统计学分析不存在差别(P>0.01)，也就是说本实验设定的时间组得到的实验结果并不能说明吴茱萸碱对与人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞系侵袭的抑制作用呈时间依赖性；这可能一方面与本实验设定的时间组之间间隔短有关系，另一方面与实验体系及不同肿瘤细胞系本身的特异性有关系。另外时间组和浓度组对于人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞系侵袭的抑制作用不存在交互性(P<0.01)。

目前，关于吴茱萸碱抗肿瘤的机制尚不确切，有文献报道，吴茱萸碱通过抑制NF-kB[9]的活性来抑制NF-kB激活通路上的关键环节阻断其激活过程，以达到阻断 NF-kB调控的抗凋亡基因及促进肿瘤细胞生长、浸润、转移的基因转录。另外通过原位分析技术，人们发现吴茱萸碱可抑制微管蛋白的多聚化和纺锤体的形成，并且进一步的研究中发现，吴茱萸碱 N-14位上的甲基和 C-13位上的氢与吴茱萸碱的抗肿瘤活性有很大的相关性[10]。亦可能与下调PLK1基因表达有关[11]。但具体机制还需进一步研究。

1 杨威，陈彪，张英怀，等．姜黄素对涎腺腺样囊性癌细胞系SACC-83增殖和凋亡的影响.现代口腔医学杂志，2009，23:142-144．

2 贾志宇，陈彪，郭立华，等．丹参酮ⅡA 对舌鳞状细胞癌细胞系 TCA-83 增殖和凋亡的影响．实用口腔医学杂志，2012，28: 59-63．

3 贾志宇,邸永宾,李晓玲,等.吴茱萸碱抑制涎腺腺样囊性癌细胞系 ACC-M 增殖的实验研究．实用口腔医学杂志,2012，28:592-596.

4 刘蕴秀,罗淑荣.吴茱萸中生物碱成分的研究新进展．天然产物研究与开发,2000,12:87-94.

5 Ogasawara M,Matsubara T,Suzuki H,et al.Inhibitory effects of evodiamine on in vitro invasion and experimental lung metastasis of murine colon cancer cells.Biol Pharm Bull,2001,24:917-920.

6 Ogasawara M,Matsubara T,Suzuki H.Screening of natural compounds for inhibitory activity on colon cancer cell migration.Biol Pharm Bull,2001,24：720-723.

7 Ogasawara M,Suzuki H.Inhibition by evodiamine of hepatocyte growth factor-induced invasion and migration of tumor cells.Biol Pharm Bull,2004,27：578-582.

8 冯蕊，何津祥，国晋菘，等.吴茱萸碱联合射线对舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞增殖、黏附和迁移的影响.肿瘤,2011,31:417-423.

9 Takada Y,Kobayashi Y,Aggarwal BB.Evodiamine Abolishes Constitutive and Inducible NF-B Activation by Inhibiting IB Kinase Activation,Thereby Suppressing NF-B- regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression Up-regulatingApoptosis and In-hibiting Invasion.J Biol Chem,2005,280:203-212.

10 Huang DM,Guh JH,Huang YT,et al.Induction of mitotic arrest and apoptosis in human prostate cancer pc-3 cells by evod iamine.J Urol,2005,173:256-261.

11 程兆明,周永静,张尤历，等.吴茱萸碱对人胃癌SGC7901细胞增殖、侵袭和保罗样激酶-1基因表达的影响．江苏大学学报(医学版)，2011，21:69-72．

ExperimentalstudyoftheeffectofevodiamineontheinvasionofsalivaryadenoidcysticcarcinomaACC-Mcells

CHENBiao,QUPengfei,JIAZhiyu,etal.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China.

ObjectiveTo investigate the effects of evodiamine on the invasive behaviors of salivary adenoid cystic carcinoma ACC-M cells.MethodsACC-M cells were treated with evodiamine at 0,0.01,0.1,1,10,100μg/ml for 2h,4h,6h,8h,10h,respectively,then transwell invasion assay was used to examine the inhibition invasion condition of ACC-M cells.ResultsAs compared with that in control group,the number of the cell though the upper chamber in the evodiamine-treatment group was decreased.The cells' number showed a gradual decreasing trend with concentration increasing and time prolonging.The invasion inhibition rate was increased with the increasing of drug concentration and action time.The highest invasion inhibition rate was 59.99%.There was a significant difference in number of the cell though the upper chamber among different concentration groups (P<0.05).ConclusionEvodiamine is able to inhibit the invasion of ACC-M cells.

evodiamine;salivary adenoid cystic carcinoma;invasion

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.09.003

项目来源:河北省医学科学研究重点课题(编号:2005007)；河北省中医药管理局项目(编号:2006093)

050000 石家庄市，河北医科大学第二医院口腔颌面外科[陈彪、屈鹏飞、贾志宇、李晓玲(现工作单位为解放军306医院口腔科)、杨威、张英怀]

R 871.7

A

1002-7386(2014)09-1290-03

2013-11-05)