大孔吸附树脂纯化二冬膏总皂苷工艺研究

★ 张理波 季巧遇 眭荣春 李露爽 张娟娟

(1.江西中医药大学 江西 南昌 330004；2.江中药业股份有限公司 江西 南昌 330096)

二冬膏收载于《中国药典》(2010年版)一部，由天冬、麦冬组成，具有养阴润肺的功效，用于肺阴不足引起的燥咳痰少、痰中带血、鼻干咽痛[1]。皂苷是麦冬、天冬中的主要有效成分，现代药理研究证明皂苷类在抗菌、抗血栓、祛痰止咳、止血、免疫调节、抗肿瘤及对心血管系统等方面有显著作用[2]。本实验采用大孔吸附树脂法对二冬膏中总皂苷进行纯化，并对其纯化工艺进行了考察，为二冬膏的二次开发提供试验依据。

1 材料与仪器

1.1 材料 贵州天冬，浙江麦冬(均购自安徽省亳州市中信中药饮片厂，经检测符合《中华人民共和国药典》2010年版一部有关各项规定)。菝葜皂苷元(含测用，中国药品生物制品检定所，批号(110744-200407)；D101型大孔树脂、AB-8型大孔树脂、NKA-Ⅱ型、CAD-40型大孔树脂、HPD600型大孔树脂(均购于南开大学化工厂)；所用试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.2 仪器 UV-1800紫外分光光度计(日本SHIMADZU)；AB204-N分析天平(梅特勒托利多仪器有限公司)；BUCHI旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；

2 方法与结果

2.1 二冬膏总皂苷的提取和含量测定

2.1.1 二冬膏提取 按二冬膏处方(天冬500g麦冬500g)称取药材，加水提取3次，每次2h，加水量分别为12倍量、10倍量、10倍量，合并提取液，过100目筛，放冷。离心20min(4000r/min)，取上清液，减压浓缩，制成浓度为0.066g生药/mL的离心液，备用。

2.1.2 供试品溶液制备 精密吸取上述二冬膏提取液3mL，加水17mL稀释，以水饱和正丁醇萃取5次(每次15mL)，正丁醇液水浴挥干，残渣用甲醇溶解，定容至10mL，摇匀，即得。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取菝葜皂苷元对照品19.01mg，置于10mL的容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 二冬膏总皂苷的含量测定[3]采用紫外分光光度法。精密吸取不同浓度菝葜皂苷对照品溶液及上述供试品溶液0.1mL，置具塞刻度试管中，70℃水浴蒸干，精密加入10mL高氯酸，65℃水浴加热显色15min取出，冰水冷却15min，摇匀，以高氯酸空白溶液做参比，于紫外分光光度计上200～700nm进行扫描，菝葜皂苷在312nm处有最大吸收，二冬膏总皂苷在310nm处有最大吸收，故选310nm为二冬膏总皂苷的测定波长。以对照品质量为横坐标，吸收值为纵坐标，得线性方程为：Y=1.4262X-0.0442(r=0.9998),表明菝葜皂苷元在0.09505mg～0.7604mg范围内与吸收值呈良好线性。

2.2 大孔树脂的预处理 取D-101、AB-8、CAD-40、NKA-2及HPD600五种大孔树脂装于烧杯中，95%乙醇浸泡24h，，以95%乙醇动态清洗至醇洗脱液加数倍水后不显浑浊，且洗脱液在200-400nm扫描无吸收峰为止，再用水洗至无醇味。

2.2 大孔树脂型号的选择 称取已处理好的D101、AB-8、CAD-40、NKA-2及HPD600五种大孔吸附树脂(相当于干树脂5g),置250mL具塞锥形瓶中，精密加入二冬膏提取液30mL(0.033g生药/mL)，20℃恒温振摇24h，分别取吸附前后的药液，按上述测定方法测定总皂苷含量，计算得不同型号树脂的比吸附量。吸附后的树脂用水洗至Mollish反应呈现阴性，再加入95%乙醇50mL，20℃恒温振摇4h，取解吸附前后药液，测定醇洗脱液中二冬膏总皂苷含量，计算不同型号树脂的洗脱率。结果见表1,可见，D101大孔吸附树脂较好，故选择D101大孔吸附树脂进行纯化。

表1 不同型号大孔树脂筛选结果(n=3)

2.3 大孔吸附树脂洗脱溶剂的选择 称取已处理好的D-101大孔吸附树脂4等份(相当于干树脂6.6g)，湿法装柱，取二冬膏提取液4份，每份30mL(0.033g生药/mL)，以2mL/min速度上样。用蒸馏水洗至Molish反应呈现阴性，分别用50%、60%、70%、80%的乙醇洗脱，收集洗脱液，每5mL一份，精密吸取0.1mL，水浴蒸干，精密加入10mL高氯酸，按2.1.3含量测定方法测定其总皂苷含量。以洗脱液体积为横坐标，总皂苷含量为纵坐标，绘制洗脱曲线，见图2，由图可知，80%乙醇洗脱效果较好。

图1 不同浓度乙醇洗脱效果

2.4 最大上样量考察 称取已处理好的D-101大孔吸附树脂(相当于干树脂23g)，湿法装柱。取二冬膏提取液(0.033g生药材/mL)上样，上样流速2mL/min，分段收集未吸附液，每份5mL，加水15mL稀释，以水饱和正丁醇萃取5次(每次15mL)，正丁醇液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至10mL，精密吸取0.1mL测定其总皂苷含量，以流出液体积为横坐标，流出液中总皂苷的泄露百分数为纵坐标，绘制泄露曲线，如图2。由图2可知，当上样量为100mL时，流出液总皂苷的浓度超过了泄液点(原始浓度的10%)，故最大上样量选择95mL，即每克树脂可吸附0.13g生药。泄漏百分数%=流出液中总皂苷含量/上柱液中总皂苷含量×100%。

图2 二冬膏总皂苷泄漏曲线图

3 验证实验

称取已处理好的D-101大孔吸附树脂(相当于干树脂23g)，湿法装柱(柱高比为1∶12)。量取二冬膏样品溶液(浓度为0.066g生药材/mL)47.5mL，以2mL/min的速度上柱，用7BV水洗至Mollish反应呈阴性后，以80%乙醇洗脱，收集约3倍柱体积洗脱液，测定上柱前后洗脱液中的总皂苷含量和总固形物量；重复3次试验，结果见表2，可见经大孔树脂纯化后，总皂苷纯度由26.59%上升为62.07%，总皂苷平均收率为73.09%，表明D-101型大孔树脂可用于二冬膏总皂苷的富集和纯化。

表2 D-101大孔树脂纯化对二冬膏提取物纯度的影响(n=3)

4 小结

4.1 大孔树脂吸附技术被广泛用于中药有效成分的分离纯化[4,5]。本文通过静态吸附试验考察了D-101、AB-8、CAD-40、NKA-2及HPD600几种不同型号大孔树脂对二冬膏中总皂苷的吸附、解吸附能力，结果D101大孔树脂纯化效果最好。

4.2 大孔树脂纯化效果的其它影响因素，如柱高比、上样流速、上样浓度、洗脱用量等，未在文章中一一阐述；文中所用参数均通过实验研究所得。

4.3 以D-101型大孔吸附树脂上柱前后的总固形物和总皂苷为指标，大孔树脂法可以有效去除杂质，使二冬膏总皂苷的纯度由26.59%上升为62.07%，平均收率为73.09%，结果稳定，基本达到了纯化效果。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典·一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：410.

[2]戴忠，姜红.甾体皂苷研究进展[J].中国药师,2003,10(9):615-616.

[3]王松,许腊英,陈栋，等．天麦颗粒中总皂苷的含量测定[J].湖北中医学院学报,2009,11(1)：40-42.

[4]蔡雄，刘中秋，王培训，等.大孔吸附树脂富集纯化人参总皂苷工艺[J].中成药,2001,23(9)：631-633.

[5]周跃华，吴笑如，徐德生，等.大孔吸附树脂纯化麦冬总皂苷的工艺研究[J].中草药,2003,34(12)：1 089-1 091.