复方冠心舒有效组分最佳配伍研究*

2014-08-29陈俊杰张馨瑜谌燕杨世林范玫玫

江西中医药 2014年7期

★ 陈俊杰张馨瑜谌燕杨世林范玫玫*

(1.江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心江西南昌 330006;2.中国药科大学江苏南京 210009)

冠心舒为中草药复方制剂，处方来源于中国药典2005年版一部“冠心丹参胶囊”，通过应用现代提取技术、精制纯化技术，对处方中丹参、三七、降香三味药材中有效部位的提取精制后，并通过药效学筛选，制成的由丹参总酚酸、三七总皂苷、降香总萜三个有效组分组成的制剂，其有效成分的配比影响着药物的疗效。

1 材料与方法

1.1 实验药物丹参总酚酸、三七总皂苷、降香油(本草天工制药有限公司提供)。

1.2 实验动物清洁级Sprague-Dawley(SD)新生大鼠(1～3d)，雌雄不限(GCI公司提供)。

1.3 主要试剂 L-NAME、胰蛋白酶、Brdu、HEPES(均为Sigma公司产品)；MTT(Ameresco公司产品)；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(Beckman公司产品)；MDA、SOD、GPx、Catalase测定试剂盒(均为Beckman公司产品)；胎牛血清、MEM培养基(GIBCO BRL公司)；其余化学试剂均为分析纯。

1.4 方法 1.4.1 心肌细胞的分离培养参照Spector等方法，取出生1～3d内SD乳鼠心脏，分离心室组织，经0.1%胰酶消化分离,用含15%胎牛血清的MEM培养基混悬后置CO2培养箱(5%CO2,37℃)培养2 h去除成纤维细胞,将悬浮的心肌细胞过200目不锈钢网,计算细胞悬液中台盼蓝拒染的活细胞数,达90%以上。再分别按5×105/孔、1×105/孔接种于24孔培养板或96孔培养板内，于CO2培养箱培养，隔天换培养液，前3 d加入终浓度为0.1 mmol/LBrdu抑制纤维细胞生长。培养4 d随机分组进行实验。

1.4.2 心肌细胞A/R模型建立心肌细胞生长接近融合状态时，对培养心肌细胞换用模拟缺氧缺糖溶液，置于持续95%N2～5%CO2平衡的A/R装置(37℃)中缺氧孵育3 h后，再换用模拟再灌注溶液于95%O2～5%CO2复氧孵育2 h。

1.4.3 冠心舒有效部位拆方实验

1.4.3.1 按冠心舒分离所得的有效部位，根据原方的基本配比比例，设计了四因素四水平正交设计表(以人每次服用剂量计算，单位：g)，如表1～2所示。

表1 因素水平表

表2 四因素四水平设计方案表 /mg·L-1

1.4.3.2 实验用培养4 d的心肌细胞，随机分为以下18组(n=8)进行实验，除上述16组外，还增设：(1)正常对照组(Control)：换正常培养液持续95%空气～5%CO2，孵育5h；(2)A/R组：实验时弃去原培养液，换模拟缺氧液，将培养板置于持续95%N2～5%CO2平衡的A/R装置(37℃)中孵育3 h后，再换模拟再灌注液，以95%O2～5%CO2复氧孵育2 h(37℃)。1～16受试组：各孔分别加入含有终浓度为1%的DMSO以及相应受试品处理的同时，进行A/R操作。

1.4.4 冠心舒有效部位最佳配比方案中，降香有效部位存在意义判断根据以上拆方实验结果，选取效果最佳配比方案，除去有效部位之一,另取心肌细胞分组进行实验(n=8)：实验分组为：正常对照组(Control)、A/R组、1%的DMSO对照组，以及相应处理组。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 细胞存活率采用MTT比色法检测；96板每孔加入MTT(5×10-3mg/L)20μL，继续培养4 h，再加入150μL DMSO，振荡10min，用酶联免疫检测仪测定各孔细胞的490 nm吸光值。设不含细胞、只加孵育液的空白对照，记录结果。细胞存活率(%)=(各试验组吸光值/对照组吸光值)×100%。

1.5.2 生化检测实验结束后各组分别取孵育液200μL，Beckman生化自动分析仪测定LDH活性。用试剂盒测量SOD、Catalase、GPx活性以及MDA含量。

2 结果

2.1 冠心舒有效部位拆方结果如表3所示：A/R组心肌细胞严重受损，细胞存活率、SOD、Catalase、GPx活性较Control组显著降低，MDA含量显著增加(P<0.01)；不同配比组合的冠心舒有效部位处理各组与A/R组相比细胞存活率、SOD、Catalase、GPx活性均有不同程度的升高，MDA含量也均有不同程度的降低(P<0.01或P<0.05)，表明冠心舒有效部位配比具有对抗心肌细胞的A/R的作用。经方差分析以及组合判断冠心舒有效部位的最佳配比组合为：丹参总酚酸2.7×10-2mg/L、三七总皂苷4.8×10-2mg/L、降香油2.625×10-3mg/L。