RP-HPLC法测定清鱼油霜中维生素A含量

★ 聂秀霞 何婉敏 陈焕梅 邱玉婷

(中山市第二人民医院 广东 中山 528447)

清鱼油霜是我院自制制剂，由鱼肝油加一系列药用基质辅料研制而成，主要用于治疗鱼鳞病、急慢性皮炎湿疹、皮肤溃疡及角化不全等，深受我院患者的好评。其主药鱼肝油系自鲛类动物Squalidae等无毒海鱼肝脏中提取的一种脂肪油，在0℃左右脱去部分固体脂肪后，用精炼食用植物油、浓度较高的鱼肝油或维生素A与维生素D3调节浓度制成，药典以维生素A和D的含量为指标作为控制其质量的标准。由于维生素A具有共轭多烯醇的侧链结构，对氧、酸和紫外线敏感[1]，化学性质不稳定，故以维生素A含量作为控制其质量的指标之一。2010版《中国药典》采用紫外-可见分光光度法或正相高效液相色谱法测定维生素A的含量，笔者参考部分文献[1,2]，采用反相高效液相色谱法测定清鱼油霜中维生素A的含量，取得了一定的效果，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦1260液相色谱仪，紫外检测器，色谱柱：Eclipse XDB-C18(4.6mm×150mm,5μm)，循环水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型，巩义市予华仪器有限责任公司)，电子分析天平(BS110S型，北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2 试药 维生素A醋酸酯(100368-201301，中国食品药品检定研究院)，甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，清鱼油霜(批号：20131201、20131101、20140201)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 安捷伦1260，紫外检测器，Eclipse XDB-C18柱(5μm，4.6×150mm)，柱温30℃；检测波长为325nm；进样量20μL，流动相为甲醇-水=95∶5；流速为1.0mL/min。

2.2 样品的制备与处理

2.2.1 对照品溶液的配制 见2.3线性范围中对照品溶液的配制，经0.45μm滤膜滤过后进样，记录色谱图，图谱见下图1。

2.2.2 阴性对照溶液的配制 取不加清鱼油的阴性清鱼油霜2g，照供试品溶液配制方法处理，经0.45μm滤膜滤过后进样，记录色谱图，图谱见下图2。

2.2.3 供试品溶液配制 取本品2g，加乙腈20mL，于50℃水浴2min使溶解，立即转移至50mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，放冷，经0.45μm滤膜滤过后进样，记录色谱图，图谱见下图3。

图1 维生素A醋酸酯对照图谱

图2 清鱼油霜阴性对照

图3 清鱼油霜样品图谱

表1 加样回收试验结果表

样品量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0.21360.07680.29326103.720.21360.07680.29436105.160.21360.07680.2890898.280.21360.15370.37500105.010.21360.15370.3631297.280.21360.15370.36818100.570.21360.30740.5142497.800.21360.30740.52862102.480.21360.30740.52776102.20101.393.01

2.3 线性范围 取维生素A对照品适量(约相当于15mg维生素A醋酸酯)，置100mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液1mL、3mL、5mL、7mL、10mL，分别置50mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，分别成不同浓度的对照品溶液。精密量取对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，回归方程为Y=119.17X+0.8525，R2=1，表明对照品溶液浓度在3.07μg/mL～30.74μg/mL之间时，线性关系良好。

2.4 加样回收试验 精密量取批号为20131201的已知浓度的清鱼油霜2g，照供试品溶液配制方法水浴，溶解，共9份，再加入已知浓度的对照品溶液0.5mL、1mL、2mL，每个浓度平行操作3次，加乙腈稀释至刻度，摇匀，按样品测定方法测定，计算回收率。结果平均回收率为101.39%，RSD为3.01%，详见表1。

2.5 重复性试验 精密量取同一批号(20131201)已知浓度的供试品2g，照2.2供试品溶液方法处理，重复进样5次，测得维生素A醋酸酯峰面积的RSD为1.37%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取2.2项下供试品溶液在0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h分别进样一次，记录色谱图，维生素A醋酸酯的峰面积RSD为0.6%，说明供试品溶液在10h内稳定。

2.7 改变色谱柱温度试验 取供试品溶液和对照品溶液各20μL，改变色谱柱温度为20℃、25℃、30℃，检测波长为325nm。分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以保留时间比值计算RSD。结果RSD为1.20%，表明耐用性良好。

2.8 样品测定 分别取批号为20131201、20131101、20140201的清鱼油霜样品2g，照2.2项下制备，照2.1项下色谱条件进样，记录色谱图，以峰面积计算维生素A醋酸酯含量，结果见表2。

表2 三批样品中维生素A醋酸酯含量

3 讨论

2010版《中国药典》采用紫外三点校正法或正相色谱法测定维生素A的含量。由于受条件限制，笔者在查阅文献基础上改进提取方法，采用反相色谱法测定清鱼油中维生素A的含量。由于清鱼油霜为霜剂，一般采用水浴破坏相平衡后提取，笔者尝试了加入少量水，水浴溶解后采用异丙醇提取，杂质峰较多，分离度较差。由于乙腈具有优良溶剂的性能，可用于合成维生素A及其中间体的溶剂，故采取乙腈为溶剂水浴提取的方法，此方法杂质峰较少，维生素A峰型良好，理论塔板数达到4000以上，与其它物质达到了良好的分离效果。相对于正相色谱法，此法不需要特殊的色谱柱，操作也相对简便，可以作为测定清鱼油霜中维生素A含量的方法。

[1]钱玲慧，廖佳宇，李亚妮，等.测定维生素A的三种方法比较[J].实验技术与管理，2012，29(5)：43-48.

[2]阳利龙，银雪花，祝文兵,等.HPLC测定血清中25-羟基维生素D3和维生素A及应用[J].儿科药学杂志，2010，16(3)：41-43.