笔管草药材质量标准研究

★ 刘大伟 赖佐发 廖宝源

(赣州市食品药品检验所 江西 赣州 341000)

笔管草为木贼科植物笔管草EquisetumdebileRoxb.的干燥的地上部分。全年可采，割取地上部分，除去杂质，晒干。用于急性结膜炎，急性黄疸型肝炎，痢疾，尿道炎，荨麻疹。微苦、甘，平。归肝经。清热利湿，明目退翳。分布于江西(赣州)、广东、福建(泉州、厦门、龙岩、三明、南平)等省区，生于山谷溪边潮湿地，为江西省赣南地区民间常用药[5]。本品收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第九册(1994年版)，原标准只有简单的性状、显微鉴别和化学反应，未对药效成分进行定性、定量检测，难以保障其药材及其成方制剂的质量和临床用药的有效性和安全性。[2]因此，本文在笔管草原标准基础上，建立了水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、山柰素的薄层鉴别和含量测定方法，为笔管草药材及其成方制剂的质量控制提供了依据。

1 仪器与试药

Agilent1260高效液相色谱仪(VWD检测器、四元低压混合泵、柱温箱、自动进样器、ChemStation色谱工作站)；DM500摄影摄影显微镜(德国莱卡；USC302超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司)；GZX-DH-40ⅹ45-BS电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；SX2-5-12 C0149箱式电阻炉(上海实验仪器厂有限公司)；梅特勒AB265-S型电子天平。

乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。山柰素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110861-200808，含量为95.9%)。10批笔管草药材为采自赣州市信丰小江(暂定批号为1 -10)，经赣州市食品药品检验所刘志辉鉴定为木贼科植物笔管草EquisetumdebileRoxb.的干燥的地上部分。

2 方法与结果

2.1 植物来源[5]多年生草本，高18～100cm，硬且粗糙。根茎横走，黑或黑褐色。茎绿色，直立，直径2～15mm，中空，基部节上有2～5分枝，稀无分枝或仅有1小枝，有棱脊6～20条，棱脊上有1列小疣状突起或小横纹，沟中有气孔线1列。叶小，轮生，下部联合成鞘筒，疏松地包围茎节，鞘片背上无棱脊，鞘齿短三角形，黑色，有易脱落的膜质尖尾，孢子束穗生于分枝及主茎顶端，矩圆形，有小尖头，长0.5～2.5cm，无柄；孢子同型，圆球状，有长弹丝4，或十字形，平时紧绕在孢子外面，遇水即弹开。孢子成熟8～10月。

2.2 药材性状 本品呈长杆状，长30～50cm，直径0.2～0.5cm,表面灰绿色或黄绿色，有6～20条棱背，节明显，节间长2～9cm，叶鞘基部和鞘齿黑棕色，鞘齿短三角形，有的可见膜质尖尾，每节轮生枝2～5条。体轻，质脆，易折断，手捻之有粗糙感，断面中空，内表面白色膜质。气微，味淡微甘。

2.3 薄层色谱鉴别

2.3.1 供试品溶液的制备 取本品粉末1g，加75%甲醇25mL，盐酸1mL，加热水解1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL溶解，用乙酸乙酯提取2次，每次10mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。[1]

2.3.2 对照品溶液的制备 另取山柰素对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。

2.3.3 薄层色谱的展开 照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，采用双槽展开缸,以环已烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶4∶0.4)为展开剂，上行展开，展距8～15 cm。

2.3.4 显色 5%三氯化铝乙醇溶液，立即置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

1. 山奈素；2～11. 笔管草药材

2.3.5 样品检识 按上述条件对10批土黄连药材进行薄层色谱鉴别，结果各斑点分离良好，显色清晰，且各批药材薄层鉴别结果一致性较好。见图1。

2.4 检查

2.4.1 水分 按照《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ H第一法测定[8]。见表1。

2.4.2 总灰分 按照《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ K测定。见表1。

2.4.3 酸不溶性灰分 按照《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ K测定。见表1。

2.5 浸出物 用水作溶剂作溶剂，水溶性浸出物测定法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅹ A)项下的热浸法测定。见表1。

表1 笔管草水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、含量测定结果

图2 对照品溶液(A)和供试品溶液(B)的HPLC色谱图

2.6 含量测定 笔管草主要含山柰素，因此本文采用HPLC法建立了笔管草药材中山柰素含量测定方法。

2.6.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil(钻石)C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液(50∶50)；检测波长：365nm；进样量：10μL；流速：1.0mL/min；柱温：35℃。理论板数按山奈素峰计算应不低于3000。见图2。

2.6.2 对照品溶液的制备 取山奈素对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得。

2.6.3 供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)约0.75g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20mL，加盐酸5mL，置水浴中加热水解1 h，放冷，转移至50mL量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。[1]

2.6.4 线性关系考察 精密吸取1.0，2.5，5.0，7.5，10.0μg/mL的山奈素对照品溶液，分别进样10μL，测定。以进样量(μg)为横坐标，山奈素峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=4046.3X-18.885，r=0.9993。结果表明山奈素在0.00998～0.0998μg范围内线性关系良好。

2.6.5 精密度试验 取本品(批号20130116)0.75g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备，精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定，重复6次，计算山奈素RSD=0.46%，表明精密度良好。

2.6.6 重复性试验 取本品(批号20130116)6份，每份0.75g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备，精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定，记录山奈素峰面积并计算RSD=0.54%， 表明方法重复性良好。

2.6.7 稳定性试验 取本品(批号20130116)0.75g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备，分别于0，2，4，6，8，12，24h测定，记录山奈素峰面积并计算RSD=0.38%，结果表明供试品在24h内稳定。

表2 山奈素加样回收率试验

2.6.8 加样回收率试验 取本品(批号20130116)6份，每份0.375g，精密称定，分别加入0.0125mg/mL的山奈素对照品溶液25mL，按供试品溶液的制备方法制备，精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定，计算山奈素的含量及RSD。结果山奈素的平均回收率为99.82%，RSD=0.14%,表明该方法回收率良好。见表2。

2.6.9 药材含量测定 取本品细粉约0.75g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，按上述色谱条件分别测定山柰素的含量，结果见表1。

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别 实验考察了供试品溶液的稳定性，每隔一定时间点样一次，在放置0，2，6，24 h内点样，结果表明：在2 h内，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。证明供试品溶液要临用新配。

3.2 浸出物测定考察 实验分别采取热浸法和冷浸法，热浸法中用水、50%乙醇、75%乙醇、乙醇分别做溶剂进行考察；冷浸法中用水、50%乙醇、75%乙醇、乙醇做溶剂进行考察，结果表明：水作溶剂热浸浸出率最高。故选取水作溶剂热浸。

3.3 灰分和酸不溶性灰分测定考察 针对本品灰分和酸不溶性灰分测定值较高，实验分别采取水洗和加10%硝酸铵溶液湿润后测定。实验所用样品均为干燥的地上部分，考虑到样品是否已洗净，如果样品带有灰尘和泥沙，均会影响最后的检测结果。所以，第一步采取水洗，净制样品，并延长炭化时间。水洗过程中，未发现有尘土和泥沙。样品的水洗前和水洗后的测定结果比较接近。考虑到考虑到样品炭化后有可能不易灰化，故采取加10%硝酸铵溶液湿润。具体操作为：当样品炭化后，放冷，加10%硝酸铵溶液3mL，使残渣湿润，置水浴上蒸干，再放进高温炉内进行炽灼，至坩埚内容物完全炭化。测定结果比较接近。因此，灰分和酸不溶性灰分测定值较高是样品成分原因。

3.4 含量测定

3.4.1 波长选择 取山柰素对照品适量，用75%甲醇制成适当的浓度，以75%甲醇为空白，在400～300nm波长范围内进行光谱扫描，结果在365nm波长处有稳定的吸收，同时参考《中国药典》中山柰素的检测波长，确定检测波长为365nm。

3.4.2 流动相的选择 参考《中国药典》中山柰素含量测定方法，采用乙腈-0.4%磷酸溶液(50∶50)为流动相体系，山柰素与其它组分分离完全，结果满意。

[1]国家药典委员会·中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中医医药科技出版社，2010：285-286.

[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.卫生部药品标准﹒中药成方制剂第九册[S].北京：中华人民共和国卫生部药典委员会出版,1996:180-181.

[3]北京市卫生局.北京中药材标准[M].北京：首都师范大学出版社，1998：211.

[4]福建省食品药品监督管理局.福建省中药材标准[M].福州：海风出版社,2006:211.

[5]中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴(第一册)[M].北京：科学出版社，1972：116.