广东紫珠干浸膏特征图谱研究*

★ 郭文 付辉政 周国平 廖圆月

(1.江西省食品药品检验所/江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心 江西 南昌 330029；2.江西中医药大学 江西 南昌 330004)

广东紫珠(CallicarpakwangtungensisChun)为马鞭草科(Verbenaceae)紫珠属(CallicarpaL.)植物，该属植物共有190余种，我国有46种，可作药用的有30种。主要分布于江西、福建、湖北、浙江等地[1]。广东紫珠收载于2010年版《中国药典》一部，具有收敛止血，散瘀，清热解毒之功效。用于衄血，咯血，吐血，便血，崩漏，外伤出血等症[2]，为民间临床妇科及各科出血症的常用药物[3]。广东紫珠干浸膏为广东紫珠经水煎煮提取制成的固体，也是治疗慢性宫颈炎引起的湿热下注，赤白带下，宫颈糜烂，出血等症抗宫炎系列品种的主要成分之一。目前，国内外学者报道了广东紫珠含有黄酮苷类、苯丙素糖苷类、三萜类、酚酸类等化合物。现代药理研究表明广东紫珠具有止血[4]、镇痛[5]、抑菌[4,6]、抗炎[4,7,8]等药理活性。由于广东紫珠易于与同属药用植物混淆，尤其是裸花紫珠和大叶紫珠，导致广东紫珠干浸膏质量无法得到保障。本课题组前期对广东紫珠水提物进行了系统的化学成分研究，研究表明其有效成分是以连翘酯苷B和金石蚕苷为代表的苯乙醇苷类化合物，同时应用HPLC法对广东紫珠、裸花紫珠和大叶紫进行了初步的比较，发现苯乙醇苷类成分在广东紫珠、裸花紫珠和大叶紫珠中含量差异非常大，因此对广东紫珠干浸膏苯乙醇苷类成分进行特征图谱研究具有重要意义。且广东紫珠干浸膏也是《中国药典》2015年版起草品种。本试验运用特征图谱技术测定了10个不同批次来源的广东紫珠干浸膏样品，建立了广东紫珠干浸膏的标准特征图谱并对共有峰进行了指认，为广东紫珠干浸膏质量控制提供了依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪(四元泵，自动进样器，二极管阵列检测器等)；Sartorius BP211D型电子天平(德国赛托利斯集团)；连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蚕苷、异毛蕊花糖苷均为本实验室自制，通过1H-NMR、13C-NMR、MS等确证了它们的结构，纯度经HPLC检测大于98%(面积归一法测得)；广东紫珠干浸膏由江西海尔思药业有限公司(批号：20130302、20130104)、江西心正有限责任公司(批号：20130201)、广西仁信制药有限公司(批号：20120201)、江西博士达有限责任公司(批号：20130102)、怀化正好制药有限公司(批号：1-1、2-1、3-1、4-1、5-1)提供；乙腈为色谱纯，磷酸等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 采用Agilent ZRBAX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液(15∶85)；检测波长：332nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；理论塔板数按连翘酯苷B峰计算应不低于3000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蚕苷、异毛蕊花糖苷对照品适量，加甲醇分别制成每1mL含连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蚕苷、异毛蕊花糖苷的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液(批号：20130201)，按“2.1”色谱条件，连续进样6次，记录各色谱峰的积分面积和保留时间。以连翘酯苷B的积分面积和保留时间为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.1%，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号：20130201)，按“2.1”色谱条件，分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h进行测定，记录特征图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.1%，相对峰面积RSD均小于2.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重现性试验 取同一供试品溶液(批号：20130201)，按照“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”色谱条件，记录各色谱峰的保留时间和积分面积，以连翘酯苷B为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.1%，相对峰面积RSD均小于2.5%，表明该实验方法的重现性良好。

表1 共有特征峰相对保留时间

2.5 共有峰的确定 在“2.1”色谱条件下，分别测定10个不同批次的广东紫珠干浸膏样品的HPLC特征图谱(图1)，选择稳定性较好、吸收性较强、特征较明显的色谱峰为共有峰，共确定4个共有特征峰，其中连翘酯苷B峰的峰面积较大且稳定，以它的保留时间(tR)为参照标准，计算各共有峰的相对保留时间，结果10批样品4个共有特征峰的相对保留时间为1.00～2.10，RSD均小于1.4%(表1)。以连翘酯苷B的峰面积为参照标准，计算各共有峰的相对峰面积(表2)。因此确定4个共有峰作为广东紫珠干浸膏定性分析的特征峰(图1)。

表2 共有特征峰相对峰面积

1.连翘酯苷B；2.毛蕊花糖苷；3.金石蚕苷；4.异毛蕊花糖苷

2.6 指纹图谱的建立 将10批广东紫珠干浸膏的指纹图谱的AIA数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版相似度软件，以表1中样品编号为20130102的广东紫珠干浸膏的特征图谱为参照图谱，采用多样本平均数矢量综合作为共有模式矢量，时间宽度设定为0.20，多点校正后，建立自动匹配特征图谱(见图2)。

图2 广东紫珠干浸膏10个批次的HPLC特征图谱

2.7 相似度评价 采用药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(A版)，对10批广东紫珠干浸膏进行相似度评价。将广东紫珠干浸膏特征图谱导入相似度评价软件，设定匹配模板，进行谱峰自动匹配，生成对照特征图谱，进行相似度评价，得到以下结果,见表3。

2.8 共有峰的鉴定 本课题组利用各种色谱技术和波谱方法对广东紫珠干浸膏特征图谱中的共有峰进行了分离和鉴定，鉴定了4个共有峰的化学结构，按照时间顺序依次为连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蚕苷、异毛蕊花糖苷。

表3 广东紫珠干浸膏相似度数据结果

3 讨论

3.1 特征成分的选择 本课题组前期对广东紫珠干浸膏进行了系统的化学成分研究，研究表明苯乙醇苷类为其特征成分。选择连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蚕苷、异毛蕊花糖苷4个苯乙醇苷类指标成分，应用HPLC法对广东紫珠、裸花紫珠、大叶紫珠中4种苯乙醇苷成分进行了比较，结果表明：广东紫珠主要成分为连翘酯苷B、金石蚕苷，毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷含量较低；裸花紫珠的主要成分为毛蕊花糖苷，异毛蕊花糖苷和连翘酯苷B含量较低，未测出金石蚕苷；大叶紫珠的主要成分为毛蕊花糖苷，未测出连翘酯苷B、金石蚕苷和异毛蕊花糖苷。上述研究结果表明：连翘酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蚕苷、异毛蕊花糖苷4个苯乙醇苷类能很好的对广东紫珠、裸花紫珠、大叶紫珠进行区分，故选择苯乙醇苷类成分作为广东紫珠干浸膏特征成分。

3.2 溶媒及提取方法考察 试验中比较过不同的提取溶媒及提取方法，如水、乙醇及不同浓度甲醇，分别回流及超声处理。最后确定以50%甲醇回流提取效果较好，有更明显的色谱峰在特征图谱上体现，能更全面的控制药材的质量，因此选择了试验中采用的提取溶媒及提取方法。

3.3 检测波长的选择 使用HPLC-DAD对供试品溶液进行全波长扫描，发现332nm为苯乙醇苷类特征波长，同时选择332nm为特征图谱的监测波长，色谱峰信息最多，可满足特征图谱信息最大化原则。

3.4 耐用性试验考察 选用了不同厂家和不同型号的色谱柱试验，如：A：YMC-PackODS-A(150mm×4.6mm，5μm)、B：AgilentZRBAXSB-C18(4.6mm×150mm，5μm)、C：DiamonsilC18(250mm×4.6mm，5μm)的色谱柱，结果表明，不同厂家的色谱柱分离效果均良好，各共有峰与参

照物峰的相对保留时间相对标准偏差均在±5%范围之内。对不同品牌或同一品牌不同型号的仪器进行了考察，如：Shimadzu LC-20A系列、Agilent 1200系列及Agilent 1260系列高效液相色谱仪，结果表明不同厂家或型号的仪器获得的色谱图相似度良好，说明本方法能适用于不同的高效液相色谱仪。

本实验建立了广东紫珠干浸膏的特征图谱测定方法，该方法稳定、可靠、重现性好，可为广东紫珠干浸膏及其它含广东紫珠干浸膏中药复方制剂制定质量标准提供参考。

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