肾综合征出血热血浆P-选择素和组织因子的变化及其与凝血功能紊乱的关系

俞建家 张东军 赵宏 袁劲涛 孙志坚

·论著·

肾综合征出血热血浆P-选择素和组织因子的变化及其与凝血功能紊乱的关系

俞建家 张东军 赵宏 袁劲涛 孙志坚

目的探讨肾综合征出血热(HFRS)患者血浆P-选择素(P-sel)、组织因子(TF)的变化及其与凝血功能紊乱的关系,以便指导临床治疗。方法27例HFRS患者按病情分为轻症组和重症组，轻症组13例，重症组14例，分别在不同病期采集抗凝血分离血浆，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测P-sel与TF，血凝固法检测凝血象，乳胶增强免疫比浊法检测D-D，自动生化仪检测血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr),血球分类仪检测血小板(Pt)参数；另取20名健康者作对照。结果在发热期，重症组血浆TF水平显著高于轻症组(P<0.01)。血浆P-sel与中性白细胞(PMN)、单核细胞(Mo)之间呈正相关(df=79，r值分别为0.661与0.513，P<0.01)。TF的变化曲线与APTT、INR、D-D、BUN的变化曲线基本一致，而与Fn、血小板的变化趋势相反。相关分析表明血浆TF与APTT、INR、D-D、BUN之间呈正相关(dg=60，r值分别为0.436、0.351、0.386、0.362，P<0.05),与Pt之间呈负相关(df=79，r=-0.405，P<0.01)。结论HFRS急性期血浆P-sel、TF水平显著上升，提示体内存在内皮细胞损伤和血小板活化。血浆P-sel与PMN、Mo呈显著正相关，表明P-sel在动员白细胞与内皮细胞的相互作用中起重要作用。血浆TF与BUN、APTT、INR、D-D呈正相关，表明TF之表达增加是引起凝血机制率乱并导致肾功能损害的重要原因。故而强烈建议在病程早期当出现DIC或DIC前期表现时宜适当应用低分子肝素等抗凝剂治疗。

肾综合征出血热；P-选择素；组织因子；D-二聚体；凝血象

肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由汉坦病毒引起的急性传染病,鼠类为主要传源，流行于欧亚地区30多个国家[1],我国受害最为严重,患病人数占世界总发病人数的90%左右。本病的基本病理变化是全身广泛性毛细血管损伤[2]，临床上出现发热、出血、血浆外渗和多器官损害。已知组织因子(TF)是外凝血途径的启动因子，P-选择素(P-sel)则参与血小板聚集以及白细胞与内皮细胞的相互作用，它们在HFRS发病机制中的作用尚少报道，本文着重探讨P-sel、TF与凝血功能紊乱的关系，报告如下。

1 资料与方法

1．1 一般资料 研究对象为2010年1月至2011年12月丹阳市人民医院收治的27例HFRS患者，均符合1997年卫生部颁布的流行性出血热诊断标准，且经血清学检查HFRS特异性IgM阳性而确诊。其中男17例，女10例；年龄22～72岁，平均年龄50岁。大多在发热期入院，少数在低血压、少尿期入院；平均入院病日为(4.2±1.5)d。按病情分型：轻型2例，中型11例，重型12例，危重型2例。为便于统计和比较，将轻型与中型合并为轻症组，重型与危重型合并为重症组；同时因低血压期持续短暂，又常与少尿期重叠，故将此二期合并统计；另取20名健康成人作对照组。

1．2 研究方法

1．2．1 血浆P-sel、组织因子(TF)检测：按病期采集抗凝血，分离血浆后置-80℃备检；二者皆用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测，试剂盒购自上海活乐生物技术有限公司。

1．2．2 凝血象用血凝固法检测，血小板计数(PLT)、平均血小板体积(MPV)用自动血细胞分析仪检测，D-二聚体(D-D)用乳胶增强免疫比浊法检测。

1．2．3 血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)检测：采用自动生化分析仪检测。

1．2．4 治疗方法：所有患者均给予液体疗法为主的对症治疗； 6病日以内入院的患者尚给予病毒唑500 mg加入输液中缓慢静滴，2次/d，或普通干扰素α2b 300万U 皮下注射，1次/d，疗程各为3～5 d。

2 结果

2．1 血浆P-sel的变化 发热期和低血压少尿期血浆P-sel显著高于恢复期和对照组水平(P<0.05)，在发热期、重症组显著高于轻症组(P<0.05),多尿期以后两组皆逐渐降至正常水平。血浆P-sel与TF之间呈显著正相关(df=60，r=0.599，P<0.01)，与WBC、PMN、Mo之间也呈正相关(df=79，r值分别为0.644、0.661与0.513，P<0.01)，P-sel的变化曲线与WBC、PMN、Mo的变化趋势大体一致。见表1、图1。

2．2 血浆TF的变化 发热期与低血压少尿期血浆TF显著高于恢复期和对照组水平(P<0.01)，重症组显著高于轻症组(P<0.01)。TF与BUN、APTT、INR、D-D之间呈显著正相关(df=60，r值分别为0.436、0.351、0.386、0.362，P<0.01),与外周血Pt之间呈显著负相关(df=79，r=-0.405，P<0.01)。见表1、图2。

注：与对照组比较，*P<0.05,#P<0.01；与恢复期比较，△P<0.05，☆P<0.01；与轻症组比较，▲P<0.05，★P<0.01

图1 HFRS重症组血浆P-sel、WBC(×109/L)、Mo(×1010/L)水平的动态变化

F:发热期,HO:低血压少尿期,P:多尿期,C:恢复期

图2 HFRS重症组血浆TF、APTT、BUN水平的动态变化

表2 HFRS患者凝血像和Pt参数的动态变化

注：与对照组比较，*P<0.05,#P<0.01；与恢复期比较，△P<0.05，☆P<0.01；与轻症组比较，▲P<0.05,★P<0.01

2．3 凝血像的变化 发热期与低血压少尿期血浆APTT、INR、D-D均显著升高，与恢复期和对照组相比P<0.01；在发热期重症组与轻症组之间也有统计学差异，重症组显著高于轻症组水平(P<0.05)。血浆Fn则与之相反，重症组前三期显著减低，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，但轻症组仅在低血压少尿期显著下降，其他各期下降均不明显。APTT、INR的变化曲线与TF、BUN的变化曲线基本一致。见表2、图2。

2．4 血小板参数的变化 病程早期血小板进行性减少，至低血压少尿期下降至低谷，重症组比轻症组下降更明显，多尿期以后逐渐回升。在血小板减低的同时，MPV则逐渐增大，随着血小板计数的上升，MPV也渐渐减小，但重症组恢复较迟，Pt与MPV之间呈负相关(df=79，r=-0.394，P<0.01)；Pt的变化曲线与APTT、INR、D-D的变化趋势相反。见表2。

2．5 血浆D-二聚体的变化 病程各期血浆D-D水平均见增高，和对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)；低血压少尿期轻、重二组之间也有统计学差异，重症组高于轻症组(P<0.05)；多尿期以后D-D水平渐有下降，但直到恢复初期仍未降至正常范围。见表2。

2．6 血清BUN、Cr的变化 发热后期BUN和Cr开始升高，少尿期达到高峰，多尿期以后逐渐复常，重症组BUN和Cr峰值明显高于轻症组(P<0.01)。

3 讨论

致病性汉坦病毒可引起两种临床综合征，一为肾综合征出血热，主要流行于亚洲和欧洲一些国家，另一为汉坦病毒肺综合征(HPS)，主要流行于美洲部份国家，二者病原体分属汉坦病毒的不同亚型。研究表明，汉坦病毒对体外培养的细胞并无直接致病变效应(CPE)，而感染后的免疫炎性反应与发病机制有很大关联[3]。近年研究发现汉坦病毒能抑制αVβ3-整合素对血管内皮细胞生长因子(VEGF)的调节功能[4]，破坏内皮细胞间的紧密连接[5]，导致内皮细胞通透性增加，本研究显示血浆P-sel、TF显著升高，便是内皮细胞损伤的重要标志。

P-sel是一种黏附分子，储存于内皮细胞Weibel-Palade小体和血小板α颗粒内，静止血小板和内皮细胞表面通常不表达P-sel，但在炎性介质、凝血酶、氧自由基等刺激后可迅速表达，故血浆P-sel增加也意味着血小板与内皮细胞已被激活。P-sel的主要功能是参与细胞间黏附和信号交流，但它必须与配体结合后方能发挥其功能，SGL-1是P-sel的主要配体。内皮细胞表达的PSGL-1与血小板表达的P-sel结合后可导致血小板黏附于内皮细胞；白细胞表达的PSGL-1与内皮细胞表达的P-sel结合后可使得白细胞在内皮细胞表面滚动黏附；这种血小板-内皮细胞-白细胞之间的相互作用可使细胞外信号向内传导，相互诱导活化、表达或释放各自特有的细胞因子参与凝血和炎性反应[6]。例如血小板可表达αⅡbβ3等黏附分子，使其聚集在血管损伤部位，形成稳固的血小板栓[7]；单核细胞可释放TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子，引起全身炎性反应[8]；内皮细胞可表达ICAM-1、E-sel，白细胞可表达L-sel、β2-整合素[9]，使白细胞稳定地黏附于内皮细胞并进而跨内皮移行，加重内皮细胞的炎症和损伤。本研究显示P-sel与WBC、PMN、Mo之间呈显著正相关，也说明P-sel在白细胞与内皮细胞的相互作用中起重要作用。

小血管损伤后暴露的组织因子可启动外凝血途径，TF相继激活FⅦ、FⅩ，形成TF-FⅦ/FⅦa-FⅩa复合物，在Ca2+参与下激活凝血酶元(FⅡ)，生成少量的凝血酶(Ⅱa)，完成凝血过程的初步阶段[10]。此后，凝血酶再激活血小板和内凝血途径的相关因子，启动内凝血途径和凝血共同途径，从而进入凝血放大阶段，此时如没有足量的抗凝血酶、组织因子途径抑制物(TFPI)等抗凝物质存在，将会产生弥散性血管内凝血(DIC)[11]。本研究显示HFRS急性期血浆TF显著升高，强烈提示这一时期存在着高凝状态。

内皮细胞、单核细胞、血小板等受到肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-1β、血管紧张素-Ⅱ(AT-Ⅱ)、凝血酶等刺激后能迅速表达TF，并通过起泡方式脱落于血液中，形成可溶性富含TF微粒，参与凝血过程[12]。我们以往的研究证明HFRS病程中血浆AT-Ⅱ、TNF-α、IL-1β均显著增加，这可能是导致血浆TF水平升高的重要原因。

血浆TF与HFRS病情明显相关，重症组TF水平显著高于轻症组，而且TF与BUN、APTT、INR之间呈显著正相关,与血小板计数呈显著负相关，说明TF水平可反映病情之轻重。

凝血的最后阶段是形成纤维蛋白。纤维蛋白原(Fg)受凝血酶作用后释出纤维蛋白肽A和肽B，形成可溶性纤维蛋白单体,后者经FⅩⅢ作用后互相交联，形成不溶性纤维蛋白，最后在纤溶酶作用下产生各种纤维蛋白降解片段(FDP)，其中含有γ链的两个交联的D片段就称为D-二聚体(D-D)。非交联的纤维蛋白和纤维蛋白原受纤溶酶作用后虽也能产生FDP,但不能形成交联的D-D,故D-D的检出既反映了凝血系统的激活，又反映了继发性纤溶的存在。HFRS急性期血浆D-D显著高于对照组水平，低血压少尿期尤为明显，说明凝血酶与纤溶酶均巳激活[13]。

血小板在止凝血过程中起着举足轻重的作用[9]，广泛性毛细血管损伤必然引起大量血小板聚集，这可能是本病早期血小板减少的最主要原因，多尿期以后损伤小血管逐渐修复，故而血小板逐渐回升。血小板变化曲线与APTT、INR、D-D的变化趋势相反，也佐证了血小板在凝血中的消耗。此外，也有人提出汉坦病毒对骨髓巨核细胞的攻击以及免疫复合物沉积于血小板表面激活补体也可能与血小板减少有关[14]。

血小板减少的同时，MPV也明显增大，这反映了骨髓巨核细胞代偿性释放幼稚血小板的速率增加，新生的幼稚血小板黏附性较强，易发生释放反应，更有利于微血栓形成，这与病程早期APTT和D-D的变化相一致。

综上所述，HFRS患者血浆P-sel与TF含量增加是内皮细胞广泛性损伤的显著标志，与病情轻重有密切联系。血浆P-sel水平与白细胞计数(包括中性粒细胞和单核细胞)呈显著正相关，表明P-sel在动员白细胞与内皮细胞的相互作用中起重要作用。血浆TF含量不仅与APTT、INR、D-D呈显著正相关，而且与BUN也显著相关，这表明TF是引起凝血机制紊乱和肾功能损害的重要原因。由此可见，在病程早期当出现DIC前期表现，如皮肤瘀点、瘀斑、顽固性休克、多器官功能障碍、血液呈高凝状态、血浆TF增高时，宜应用低分子肝素、重组人活化蛋白C或低分子右旋糖酐等抗凝剂治疗，以便改善微循环，提高抗休克治疗的成功率。

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ThechangesofP-selectinandtissuefactorinhemorrhagicfeverwithrenalsyndromeandthecorrelationbetweenthechangesandbloodcoagulationfunctiondisorder

YUJianjia,ZHANGDongjun,ZHAOHong,etal.DanyangMunicipalPeople’sHospital,Jiangsu,Danyang212300,China

ObjectiveTo investigate the changes of P-selectin (P-sel) and tissue factor (TF) in hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) and the correlation between the changes and blood coagulation function disorder,so as to direct clinical treatment.MethodsTwenty-seven patients with HFRS were divided into two groups according to the severity of illness,mild case group (n=13) and severe case group (n=14),and 20 healthy subjects were served as control group.The levels of plasma P-sel and TF were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),coagulogram was measured by immunoturbidimetry,blood urea nitrogen (BUN) and creatinine (Cr) were detected by automatic biochemical analyzer,and platelet parameters were determined by automatic blood cell classification analyzer for both groups.ResultsIn pyretogenic stage of HFRS,the plasma levels of TF in severe case group were significantly higher than those of mild case group (P<0.01).The plasma levels of P-sel were positively correlated to those of polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes (mo) (r=0.661,0.513,P<0.01).The change curve of TF was basically coincident with that of APTT,INR,D-D,BUN,however,which was opposite to that of Fn,platelet.The correlation analysis showed that the plasma levels of TF were positively correlated to those of APTT,INR,D-D,BUN (r=0.436,0.351,0.386,0.362,respectively,P<0.05),however,which were negatively correlated to those of Pt (r=-0.405,P<0.01).ConclusionThe plasma P-sel plays an important role in promoting the interaction between white blood cell and endothelial cells.The increase of TF expression is the important reason of causing clotting mechanism disorder and resulting in renal function lesion.

hemorrhagic fever with renal syndrome;P-selectin;tissue factor;D-dimer;coagulogram

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.04.002

212300 江苏省丹阳市人民医院(俞建家、张东军、赵宏、袁劲涛)；江苏省人民医院(孙志坚)

孙志坚，210029 江苏省人民医院；

E-mail：njsunzj@163.com

R 512.81

A

1002-7386(2014)04-0488-04

2013-08-02)