不同水平亚硒酸钠对公鸡睾丸组织结构及精原干细胞增殖的影响

姚晓磊，宋瑞高，李彦霖，崔静肖，石 磊

(山西农业大学 动物科技学院 动物遗传育种与繁殖，山西 太谷 030801)

自1817年被发现以来，硒(Se)在生物体内广泛的生物学作用越来越受到人们的重视，1973年世界卫生组织(WHO)宣布硒是生物体内必需的微量元素。近些年来，随着科学技术的不断进步，硒的相关研究也越来越广泛。据报道，硒是雄性动物精子发生过程中必不可少的微量元素，睾酮生物合成和精子正常成熟过程中需要硒的参与。因此，硒是维持雄性生殖力的基本元素。Flohe的研究组发现，在精子的发育成熟过程中，谷胱甘肽酶对保护精子抗氧化损伤是重要的，但成熟精子线粒体膜含有丰富的膜型谷胱甘肽过氧化物酶，占膜结构组份的50%，且失去酶催化功能。进一步分析发现，酶活性的丧失是由于蛋白质分子聚合为无功能形式，并据此提出模型谷胱甘肽过氧化物酶在精子发育的早期具有酶活性，而在成熟精子中则发生聚合变构为一种结构成份，维持精子的正常形态和活力，这解释了低硒引起的精子活动力下降及头尾的断裂现象[1]。最近发现，硒蛋白也参与精子发育和成熟过程[2]。本试验通过在日粮中添加不同水平亚硒酸钠(0、0.5、1和2 mg/kg)饲喂海兰白成年公鸡，探讨硒对公鸡睾丸组织结构及精原干细胞增殖的影响，以期为硒在家禽生产中的应用和精原干细胞的相关研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取80只体重相近、健康无疾病的海兰白成年公鸡，随机分成4组，每组20只，之后严格按照免疫程序进行免疫。对照组饲以基础日粮；硒处理组分别在基础日粮中添加0.5、1和2 mg/kg的亚硒酸钠。

1.2 饲养管理

本实验的饲喂期共50 d，试验前，对所有的实验鸡进行驱虫，圈舍进行消毒。以基础日粮预饲10 d后，开始饲喂相应的试验日粮，试验期40 d。分别在9：00时和19：00时定量饲喂试验公鸡，自由饮水，且在试验期保证鸡舍通风。

1.3 样品采集和处理

试验结束时，采用颈部放血法处死鸡，解剖取睾丸组织样品，用手术刀轻轻切成5 mm×5 mm×2 mm的组织块，4%多聚甲醛固定24 h后置于70%乙醇保存。组织块在常规脱水、浸蜡后制作石蜡切片，然后采用免疫荧光法观察精原干细胞的数量。

1.4 睾丸组织结构的观察

1.4.1 石蜡包埋和切片

①组织块修整；②洗涤；③脱水；④透明；⑤浸蜡；⑥包埋；⑦切片。

1.4.2 免疫荧光

依次进行下列操作：将切片从4 ℃取出，烤片30～50 min；脱蜡至水；用3%的双氧水灭活；用抗原修复液进行抗原修复；用5% BSA封闭；孵育适宜的一抗(兔IgG)；孵育荧光标记的二抗；复染；封片、镜检。

1.5 统计分析

用SPSS 13.0统计软件对所测定的数据进行方差分析，然后通过Duncan’s法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同水平的硒对睾丸组织结构的影响

免疫荧光(如图1)观察睾丸组织结构发现，各处理组公鸡睾丸中均有不同数量的精原干细胞，但差异较大。对照组曲精细管管壁较完整，可观察到较多的精原干细胞(图A)；0.5 mg/kg组睾丸的曲精细管管壁较对照组更完整，精原干细胞密度大，数量最多(图B)；1 mg/kg组曲精细管管壁较完整，但精原干细胞数量较A、B组少(图C)；2 mg/kg组曲精细管已经发生部分溶解，精原干细胞也相对较少(图D)。

图A：0 mg/kg

图B：0.5 mg/kg

图C：1 mg/kg

图D：2 mg/kg

2.2 不同水平的硒对公鸡精原干细胞数量的影响

图2 不同浓度硒处理免疫荧光结果

由图2可知，日粮中添加适量的硒对精原干细胞的增殖有显著影响(P<0.05)，其中0.5 mg/kg组显著高于对照组、1 mg/kg组和2 mg/kg组，分别是它们的1.36、1.12和1.79倍。在硒处理组中精原干细胞的数量随着日粮中硒浓度的增加而降低，且差异显著(P<0.05)。并且2 mg/kg组的精原干细胞数量少于对照组。

3 讨论

有关硒对动物体生殖系统影响的报道已经很多。Smith等用放射性同位素的方法研究测定了公牛多种器官中硒的分布状况，发现除肾外，以睾丸、附睾、前列腺、精囊腺组织中的含量最高，这表明硒与动物生殖密切相关[3]。Parminder Kaur报道，在小鼠日粮中添加0.2 mg/kg硒，睾丸曲精细管中减数分裂期精母细胞、未成熟精子细胞都极显著地高于未补充硒组的小鼠[4]。公猪日粮中添加0.5 mg/kg硒，睾丸曲精细管中生殖细胞和支持细胞的数目显著增加[5]。张建新通过对公鸡睾丸的研究发现，基础日粮中严重缺硒会导致公鸡睾丸生殖上皮细胞层数较少，无精子形成[6]。石磊等在公羔羊日粮中添加不同浓度的母源硒，以研究硒对睾丸组织的影响中发现，饲喂母羊的日粮硒浓度高于4.0 mg/kg，会导致其公羔各级生精细胞数量减少，细胞间隙增大[7]。还有报道，给雄性老鼠日粮中添加低浓度硒，其睾丸和附睾的重量降低，畸形率增加，有效活精子数减少[8，9]。Scott等[10]在男性的试验研究中，也得出同样的结果。Wu等[11]报道，在大鼠日粮中添加硒可以减少头尾断裂的精子数，从而提高精子的活率，并进一步证实精子头尾的断裂情况与硒含量的状况有关。

冯丽芳等[12]以出生24 h的昆明小鼠颅骨为材料，通过酶消化法来分离成骨细胞，并分别接种于不同浓度的亚硒酸钠培养液(0.00、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.75、1.0 mg/L)中，倒置显微镜下观察成骨细胞的形态变化，采用MTT法测定细胞增殖率，结晶紫染色法测定细胞活力。48 h内，浓度高于0.4 mg/L时亚硒酸钠抑制细胞增殖且降低细胞活力，而低于0.2 mg/L时亚硒酸钠可促进细胞增殖，增强了细胞活力。结果显示硒对成骨细胞的增殖和活力呈双向调节，硒作用呈浓度剂量依赖性。贾永清等[13]以不同浓度的亚硒酸钠作用于HL-60细胞后，分别采用台盼蓝拒染法计数活细胞，MTT法检测细胞增殖抑制；通过光镜及双染流式细胞检测分析细胞凋亡，研究发现亚硒酸钠能有效抑制HL-60细胞的增殖及存活，且能够诱导其凋亡，抑制率及凋亡率与药物剂量相关。

4 小结

本实验研究表明，日粮中添加不同浓度的硒，对睾丸的发育及精原干细胞的增殖有很大的影响，其中0.5 mg/kg对其促进作用最明显，2 mg/kg已经有了很明显的抑制作用。对于硒对睾丸的发育及精原干细胞增殖影响的最适浓度，目前尚无定论，须进一步研究。

[1] 李景岩.硒的生物学作用[J].中国地方病防治杂志，2013，28(2)：96-98.

[2] 黄峙.硒的生物活性与相关疾病[J].生物学通报，2006，41(3)：17-19.

[3] Smith O B，Akinbam I O.Micronutrients and reproduction in farm animals[J].AnimalRepro-duction Science，2000(60 /61)：549-560.

[4] Parminder Kaur，M Sc，Mohinder P Bansal.Effect of selenium-induced oxidative stress on the cell kinetics in testis and reproductive ability of male mice[J].Nutriton，2005，21：351-357.

[5] Marin-Guzman J，Mahan D C，Whitmoyer R.Effect of dietary selenium and vitamin E on spermatogenic development in boars[J].J Anim Sci，2000，78：1537-1543.

[6] 张建新，岳文斌，李宏全，等.硒对公鸡睾丸组织细胞结构的影响[J].中国兽医学报，2004，24(3)：268-270.

[7] 石磊，任有蛇，张春香，等.不同水平母源硒对黎城大青羊后代公羔睾丸发育的影响[J].中国草食动物，2011，32(1)：9-12.

[8] Kaur R，Parshad V R.Efects of dietary selenium on differentiation，morphology and functions of spermatozoa of the house rat[J].Rattus mttus L.Mutat Res，1994，309(1)：29-35.

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[10] Scottr，Macpheron A，Yates R W，et al.The effect of oral selenium supplementation on human spermmotility[J].Bri J Urol，1998，82(1)：76～80.

[11] WU A S H，Oldfield J E，Whanger，et al.Effect of selenium，vitamin E and antioxidants on testicular functionin rat[J].Biol Reprod，1973，8：625-629.

[12] 冯丽芳，吴培福.硒对体外培养小鼠成骨细胞形态、增殖和活力的影响[J].畜牧兽医学报，2007，38(8)：856-860.

[13] 贾永清，滕 熔等.亚硒酸钠对HL-60细胞增殖、凋亡影响及作用机制探讨[J].交通医学，2011，25(2)：121-125.