Goniurosaurus indet.的有效性及中国睑虎属(Squamata: Sauria: Eublepharidae)种间的亲缘关系

张 洁, 庆 宁*, 易祖盛, 王英勇, 江晓汕, 卢文华, James Lazell

(1.华南师范大学 生命科学学院, 广东省高等学校生态与环境科学重点实验室, 广东省水产健康安全养殖重点实验室, 广州 510631；2.广州大学 生命科学学院, 广州 510006；3.中山大学 生命科学学院生物博物馆, 广州 510275；4.华南农业大学 生命科学学院, 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广州 510642；5.美国罗德岛州生物保护所, RI 02835，美国)

睑虎属(Goniurosaurus)动物隶属爬行纲(Reptilia)有鳞目(Squamata)蜥蜴亚目(Sauria)睑虎科(Eublepharidae), 原隶属壁虎科(Geckonidae). 多生活于溪流或河流岸边的石缝或洞中, 昼伏夜出, 行动迟缓, 以小型无脊椎动物为食. 目前全世界睑虎属(Goniurosaurus)共有14种, 主要分布于东亚南部, 中国现已命名的睑虎有6种[1]. 依据李德俊等[2]的报道, 中国动物志[3]上仅记载里氏睑虎Goniurosauruslichtenfelderi(Mocquard)[4]一种. 但是, 近年来在中国境内分布的睑虎种类研究有所进展[5], 不仅证实海南睑虎G.hainanensisBarbour[6]不同于G.lichtenfelderi, 而且又相继发现了4个新种: 凭祥睑虎G.luii[7]、霸王岭睑虎G.bawanglingensis[8]、英德睑虎G.yingdeensis[9]、荔波睑虎G.liboensis[1]. 之前发现的广东新记录的睑虎属未定种Goniurosaurusindet.[10]和英德睑虎G.yingdeensis的发现地点距离不远, 仅以珠江水系北江的最大支流连江一河相隔, 体色、花纹以及背部横纹的数目也相似, 但在生境和其它形态上却有明显的差异. 前者生活于洞穴, 后者生活于靠近村落建筑物的隙缝; 特别是前者成年雌性没有肛前孔而后者却有, 背部横纹的颜色和宽窄不同, 以及第四趾下瓣数量不同等. 因此, 本文重点研究这两者之间的遗传差异和它们与睑虎属其它种类的亲缘关系.

在系统发育研究中, 常用贝叶斯演绎法(bayesian inference, BI)[11]、最大似然法(maximum likelihood, ML)[12]、最大简约法(maximum parsimony, MP)[13-14]、邻接法(neighbor-joining, NJ)[15]来分别构建系统发育树. Ota等[16]依据线粒体(mtDNA: 12S rRNA及16S rRNA)分子数据建立了睑虎科的NJ系统树, 认为所有日本种类聚为一支并形成G.kuroiwae单系群. Grismer等[7]基于形态学，初步建立了当时已知睑虎种类的亲缘关系，4条背部横纹(包含nuchal loop)是祖征(pleisiomorphic), 具此特征的种类形成单系群(monophyletic), 其中里氏睑虎G.lichtenfelderi与海南睑虎G.hainanensis形成单系之后, 再与日本的G.kuroiwae单系形成一支; 具有5条背部横纹的凭祥睑虎G.luii与蛛纹睑虎G.araneus形成单系之后, 再与海南岛的霸王岭睑虎G.bawanglingensis形成另一支. 在这些基础上, 利用形态学数据、生理学特征、分子数据(12S rRNA及16S rRNA)所得到的睑虎科MP系统树[17]与早期的结果基本一致. 利用4种mtDNA基因片段(12S rRNA、16S rRNA、完整ND2及其侧翼基因)对睑虎科已知物种及壁虎科部分物种进行分析所得的BI系统发育树[18]则不尽相同, 其中G.luii与G.araneus先聚成单系后再与G.lichtenfelderi聚成一支, 最后才与G.kuroiwae单系聚成睑虎科的整个分支. Wang等[1]最近利用16S rRNA所得的BI、ML、MP系统发育树与早期的形态学及分子数据的结果存在重要的分歧, 完全不同于上述所有研究，认为具有4条背部横纹的种类形成单系群的结论.

本文结合前人研究的结果, 利用mtDNA的12S rRNA和16S rRNA基因片段序列差异进行分析, 比较BI、ML、MP、NJ四种系统发育分析方法的结果,探讨Goniurosaurusindet.是否为有效种, 建立了我国睑虎属的系统发育树, 为世界睑虎属的系统发育和分类研究补充了基础资料和理论依据, 也为物种保护和濒危评估提供了重要的参考数据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

共有8个睑虎样品用于检测mtDNA的12S rRNA和16S rRNA基因片段序列, 包括广东省睑虎属新记录Goniurosaurusindet.的3个个体、英德睑虎G.yingdeensis的3个个体、华南师范大学(SCNU)动物标本室收藏的海南睑虎G.hainanensis的2个个体(表1). 从Genbank上获取了含12S rRNA和16S rRNA的仅有的9个睑虎mtDNA序列, 并以大壁虎Gekkogecko作为外类群(表1).

表1 睑虎属及其外类群样品信息及Genebank线粒体基因片段登录号

1.2 基因组DNA扩增和测序

采用上海生物工程技术服务有限公司购买的基因组DNA抽提试剂盒及其所示方法进行DNA的提取. 用于扩增12S rRNA及16S rRNA序列的特异引物[18]分别是Gec12S-1L (5′-CCTAGAGGAGCCTGTCCTATAA-3′), 12SB-H (5′-CAGAGGGTGACG-GGCGGTGTGT-3′)和16S-5L (5′-GGTMMYGCCTGCCCAGTG-3′), 16SBR-H (5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′). 用于扩增12S rRNA及16S rRNA基因片段序列的聚合酶链式反应(PCR)的25 μL体系包括PCR Master Mix 12.5 μL (含MgCl2、dNTP Mix、Taq 酶)、上下游引物各1.0 μL (ng/μL)、DNA样品1.0 μL, 用ddH2O补足25 μL. 反应程序包括94 ℃预变性4 min, 然后进行35个循环, 每个循环包括94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 最后72 ℃延伸8 min, 4 ℃保存. PCR产物用1%琼脂糖电泳检测样品扩增情况, 然后送至上海生物工程技术服务有限公司完成纯化和测序.

1.3 数据处理

使用DNABASER 2.91.5软件(http://www.dnabaser.com)和CLUSTAL X 1.81软件[19]对序列进行比对, 辅以人工校正. 利用MEGA 5.0软件[20]计算分子多样性参数(如多态位点个数、转换颠换比例), 并利用其中的双参数法[21]计算种间、种内遗传距离. 使用PAUP 4.0b10软件[22]中的ML、MP、NJ分别构建系统发育树. ML、MP、NJ均采用启发式搜索(heuristic search), TBR (tree bisection reconnection)枝长交换, 1 000次抽样自展(bootstrap)来分析评估系统发育各分支的支持率, 对其中所有核苷酸位点不进行加权处理, 位点空位亦视为缺失状态. 在构建系统发育树前, 还对两个mtDNA基因片段进行分划同质性检验(partition homogeneity test)[23], 评价片段序列联合分析的可靠性, 结果(p=0.124)显示两个基因片段可以进行联合分析. 采用MRBAYES 3.1.2软件[11]构建BI树, 其中MCMC(Markov Chain Monte Carlo)算法以随机树为起始树, 运行1 000 000代, 每100代取样1次, 开始的2 500个样本作为老化样本(burn-in)舍弃. 在用BI、ML、NJ法构建系统发育树之前, 先用MRMODELTEST 3.7软件[24]获得最适合本研究序列矩阵的核苷酸替代模型及相关参数, 在AIC标准下(Akaike information criterion)[25], 12S rRNA和16S rRNA基因片段联合数据的模型为GTR+G.

2 结果与分析

2.1 DNA序列特征

经软件比对辅以人工校正后, 共获得睑虎属Goniurosaurus和大壁虎Gekkogecko17个样品的12S rRNA序列共385 bp, 16S rRNA序列共477 bp, 2个基因片段合并后序列共为862 bp; 其中核苷酸变异位点388, 简约信息位点269. 碱基T、C、A和G的平均含量分别为21.8%、24.9%、35.0%和18.3%, 转换颠换比为1.07.

2.2 遗传距离特征

依据Kimura双参数法所得的净遗传距离(表2)显示睑虎属Goniurosaurus种间遗传距离为0.011～0.295, 其中睑虎属未定种Goniurosaurusindet.与英德睑虎G.yingdeensis之间的遗传距离为0.044～0.046, 而内外类群之间的遗传距离则较远, 均介于0.302～0.412. 海南睑虎G.hainanensis与睑虎属其它物种的种间遗传距离较大, 均介于0.250～0.295, 接近外类群大壁虎Gekkogecko与睑虎属Goniurosaurus之间遗传距离的下限.

表2 睑虎属线粒体基因片段12S rRNA和16S rRNA联合数据的种间和种内遗传距离(下三角)及标准误差(上三角)

2.3 系统发育和物种亲缘关系

以2个基因片段的联合数据采用MP和NJ法分别构建的系统发育树的拓扑结构基本一致(图1A). 睑虎属Goniurosaurus的17个个体由3个主分支构成; 主分支a仅包含海南睑虎G.hainanensis;G.kuroiwae类群形成单系后与在地理上相距较远的里氏睑虎G.lichtenfelderi共同聚成主分支b; 主分支c由2个单系构成, 睑虎属未定种Goniurosaurusindet.与英德睑虎G.yingdeensis形成单系后, 再与由凭祥睑虎G.luii和蛛纹睑虎G.araneus形成的单系聚成主分支c. 具有4条背部横纹的G.hainanensis、G.lichtenfelderi和日本的G.kuroiwae类群位于树的根部, 表现祖征性状.

以2个基因片段的联合数据采用ML法所建的系统发育树(图1B)与MP和NJ法所建的系统发育树的结果略有不同. 虽然也形成3个主分支, 其中主分支a与MP和NJ树相似, 均仅由海南睑虎G.hainanensis个体构成, 但是主分支b和c不尽相同. 日本的G.kuroiwae类群独自构成主分支b; 里氏睑虎G.lichtenfelderi脱离MP和NJ树的主分支b, 构成主分支c的2个亚分支之一; 另一个亚分支与MP和NJ树的主分支c基本一致. 系统发育树也显示具4条背部横纹是祖征.

以2个基因片段的联合数据采用BI法所建的系统发育树(图1C)与其它3种方法构建树的拓扑结构也不尽相同. MP和NJ树的主分支c中的2个单系关系保持不变, 其中睑虎属未定种Goniurosaurusindet.与英德睑虎G.yingdeensis这一单系在此构成主分支c, 而凭祥睑虎G.luii和蛛纹睑虎G.araneus这一单系在此构成主分支b. 主要不同于上述ML、MP、NJ结果的是具有4条背部横纹类群的亲缘关系; 海南睑虎G.hainanensis没有单独构成一个主分支, 而是同里氏睑虎G.lichtenfelderi和日本的G.kuroiwae类群共同聚为主分支a, 但是系统发育树也显示具4条背部横纹的种类形成单系群.

3 讨论

3.1 广东新纪录的睑虎属未定种Goniurosaurus indet.及其亲缘关系

由BI、ML、MP、NJ 4种方法所构建的系统发育树(图1)均显示睑虎属未定种Goniurosaurusindet.与英德睑虎G.yingdeensis构成姐妹支, 首次揭示二者亲缘关系最近. 这2个广东新种类[9-10]分布区域相同, 环境地貌相似, 均为喀斯特石灰熔岩, 多岩洞和石缝, 利于睑虎生存和隐藏. 但是, 它们两者之间的遗传距离(0.044～0.046)远远大于各自种内个体间的遗传距离(0.000～0.002), 并且与分类地位已经明确的蛛纹睑虎G.araneus与凭祥睑虎G.luii两种之间的遗传距离(0.051)接近(表2), 也接近新种荔波睑虎G.liboensis与G.luii两种之间的遗传距离(0.043)[1]. 虽然Goniurosaurusindet.与英德睑虎G.yingdeensis两者的地理分布距离较近, 采集地仅相距约62 km, 但是两地之间有宽阔的连江干流相隔. 连江是珠江水系中北江的最大支流, 珠江及其主要支流的形成可以追溯到至今约1亿年前的中生代上白垩纪[26]. 我们推测宽阔的水域可能造成地理屏障, 致使睑虎长时间不能沿着山岭扩散, 彼此隔离不能进行基因交流, 逐渐适应了不同的生境, 导致连江两岸的睑虎发生分化. 再结合两者在形态上已有的显著差异(体色、第四趾下瓣数量、雌性肛前孔有或无)[9-10], 我们认为Goniurosaurusindet.有可能是睑虎属新种, 与英德睑虎G.yingdeensis构成姐妹种, 成为G.luii类群的新成员.

图1 基于睑虎属Goniurosaurus线粒体基因片段12S rRNA及16S rRNA联合数据而构建的系统发育树及其3个主分支a、b、c内外的支持率

3.2 地理亲缘关系

Grismer等[7-8]将睑虎分为3个类群(group), 分别是G.lichtenfelderi类群、G.kuroiwae类群和G.luii类群; 前2个类群的种类在形态上均具有4条背部横斑纹, 后一类群的种类则具有5条背部横斑纹. 我国的睑虎种类中, 里氏睑虎G.lichtenfelderi和海南睑虎G.hainanensis属于G.lichtenfelderi类群;G.luii类群包括凭祥睑虎G.luii、霸王岭睑虎G.bawanglingensis、英德睑虎G.yingdeensis、荔波睑虎G.liboensis和未定种Goniurosaurusindet. 由BI、ML、MP、NJ 4种方法所得的系统发育树(图1)均支持在G.luii类群中, 凭祥睑虎G.luii和蛛纹睑虎G.araneus的关系较为密切, 新发现的英德睑虎G.yingdeensis和睑虎未定种Goniurosaurusindet.的关系同样如此. 这2对姐妹种类均分布于内陆地区并彼此相邻, 其亲缘关系符合地理距离决定分化的规律.

由ML、MP、NJ三种方法所构建的系统发育树(图1)均支持具有4条背部横纹是祖征(pleisiomorphic), 并且BI树(图1)也支持具有4条背部横纹特征的种类形成单系群(monophyletic)这一长期的形态学和分子生物学结果[7,16-18]. 具有不同背部横纹数目的种类没有分别形成单系群的矛盾结果[1]可能与检测样品数目、基因片段长短、外类群的选用等都有关系; 后者仅采用了一个序列较短的基因片段, 其选用的外类群与睑虎种间的遗传距离重叠.

3.3 海南睑虎Goniurosaurus hainanensis的特殊性

由BI、ML、MP、NJ 4种方法构建的系统发育树(图1)均显示海南睑虎G.hainanensis不但与睑虎属其它物种存在显著的遗传分化(没有与其它任何睑虎构成姐妹支); ML、MP、NJ 3种方法所建的系统发育树(图1)也均表明海南睑虎G.hainanensis的系统发育地位最为原始(位于树的底端); 其与睑虎属其它物种之间的遗传距离之大甚至接近壁虎属Gekko与睑虎属Goniurosaurus之间的遗传距离(表2). 长期以来, 前人认为G.hainanensis和里氏睑虎G.lichtenfelderi形成单系[1,7,17]. 但是, 我们研究的结果与上述文献不一致, 揭示了G.hainanensis独特的系统发育和分类地位, 暗示海南岛在睑虎属起源研究上的地理重要性.

4 结论

广东新纪录的睑虎属未定种Goniurosaurusindet.可能是新种, 其与英德睑虎G.yingdeensis组成姐妹种, 成为睑虎属G.luii类群的一个新成员. 具4条背部横纹是祖征, 具5条背部横纹为衍征. 本文首次提出的“河流隔离”假说可能对进一步解释全球睑虎属物种的亲缘地理分布格局具有重要意义. 睑虎属Goniurosaurus种类稀少, 分布较为狭窄, 中国境内外相继发现的部分新种和旧种之间的地理分布区重叠. 因此, 了解它们的地理亲缘关系和系统地位十分必要, 也是濒危评估、保护对策制定的基础. 同时由于非法宠物贸易的威胁, 国外大多数种类已经列入各国的物种红色名录, 而目前中国物种红色名录[27]仅将凭祥睑虎G.luii列入近危(NT)保护级别. 由此可见, 中国睑虎属研究在物种分化、生态学、亲缘地理方面仍需进一步深入, 为重点关注保护睑虎奠定理论和应用基础.

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