CdTe-JA偶合物的制备和应用

高艳红， 王玉洁， 何 桂， 俞 英

(华南师范大学化学与环境学院,广州 510006)

量子点(QDs)作为一种新型荧光探针，具有许多优良的光谱性能，将成为未来生物标记研究的一个重要工具[1].在生物应用中，由于生物体系组成十分复杂，针对某一对象进行研究，需要引入一些具有特异性识别功能的基团，如免疫抗体，核酸适配体等.用功能基团对量子点进行修饰，可以得到能应用于复杂体系的靶向探针[2].

对量子点进行功能化的方法主要有：静电作用、化学偶联、免疫反应、链亲和素与生物素结合等，这些方法将具有特异性识别功能的基团连接到量子点表面[2-3]. 其中化学偶联是应用较多的一种方法.化学偶联需要用到偶联剂，常见的有戊二醛和碳化二亚胺类等. 其中，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联剂具有无毒和生物相容性好的特点[4-5].

茉莉酸(JA)是一种重要的植物激素，对于植物的防御反应和生长发育具有重要的调节和控制作用[6]，由于植物体系组成十分复杂，且JA自身不发荧光，对认识JA的作用机理带来困难. 为此，基于量子点的光学特性，JA能选择性识别JA结合蛋白，用偶联剂将两者组装在一起得到茉莉酸结合位点探针，在激素信号转导过程中引入可测量的信号源，建立JA机理研究的新方法.

本研究利用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为偶联剂，将巯基乙胺修饰的CdTe量子点表面的氨基与茉莉酸(JA)的羧基进行缩合反应，得到茉莉酸结合位点探针CdTe-JA，并探讨该探针的性能，对绿豆幼苗组织进行了荧光标记的影响.

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

F-2500型荧光光谱仪(日本日立公司)；UV-Vis 1700型紫外-可见分光光度计(上海天美科学仪器公司)；MH-20荧光显微镜(日本尼康)；IR Prestige-21傅立叶变换红外光谱仪(日本岛津公司)；pHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)；HZ-8802S型恒温水浴锅(广州国凌仪器有限公司).

巯基乙胺(盐酸盐99%)，茉莉酸甲酯(95%)，碲粉(99.9%)，NaBH4(99%)，CdCl2·2.5H2O(99.9%)均购于Aldrich公司；异丙醇(广州化学试剂公司)，N-羟基琥珀酰亚胺(北京百灵威科技有限公司)；实验用水均为二次蒸馏水.

1.2 实验方法

1.2.1 CdTe/MA QDs的制备及纯化 NaHTe的制备参考文献[7]并略作修改. 向装有搅拌磁子的小玻璃瓶中依次加入1 mL已通N2饱和的二次水，0.040 0 g(1.0×10-3mol)NaBH4(易吸潮，迅速称量)，轻轻振荡小瓶，使之完全溶解，然后加入0.063 8 g(5.0×10-4mol)Te粉. 盖上带针头(排气)的胶塞，并把导气管插到液面下液封，置于恒温磁力搅拌器上，40 ℃恒温反应30 min，溶液呈无色透明后置于4 ℃恒温反应30 min，上清液即0.5 mol/L的NaHTe水溶液.

在100 mL的三颈圆底烧瓶中注入50 mL二次水，通氮气30 min后，依次加入0.092 4 g(4.0×10-4mol)CdCl2·2.5H2O和0.109 g (9.6×10-4mol)MA·HCl，调节溶液pH至5.50，继续通氮气30 min后，注入新制的NaHTe 100 μL(5.0×10-5mol)，反应物摩尔比为Cd2+∶HTe-∶MA=1∶0.25∶2.4， 在100 ℃水浴中恒温回流40 min，得橙红色CdTe/MA QDs溶液.

取一定体积的量子点水溶液，向其中加入2倍体积的异丙醇，摇匀，12 000 r/min转速离心5 min,得到沉淀物，重新分散在等体积的pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液中，4 ℃冰箱中避光保存.

1.2.2 CdTe-JA偶合物的制备 参考文献[8]，准确称取0.400 0 g茉莉酮酸甲酯(MJA)，加入5.0 mL水和5.0 mL KOH(4%)溶液，50 ℃水浴加热，2.5 h后形成澄清溶液，冷却至室温，用1 mol/L的盐酸调节溶液的pH值为3.60，乙酸乙酯萃取3次，蒸馏水洗涤3次，无水MgSO4干燥过夜，过滤浓缩后得到无色油状液体茉莉酸.

准确称取0.067 3 g (3.2×10-4mol)JA，溶解在1 mL DMF中，再用二次水定容到10 mL，得到浓度为3.2×10-2mol/L的JA溶液. 准确移取上述JA溶液2 mL(6.4×10-5mol)，加入新配置的640 μL 0.1 mol/L(6.4×10-5mol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，缓慢搅拌，37 ℃活化5 min[9]，向混合液中加入10 mL实验1.2.1得到的CdTe/MA量子点溶液，反应物的摩尔比为MA∶NHS∶JA=3∶1∶1(MA的量按最初合成量子点时加入量计算)，反应30 min.反应结束后4 ℃过夜终止反应. 用pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液对偶合物粗产品透析30 min.

1.2.3 CdTe-JA偶合物对植物组织的荧光标记 取培养3 d的绿豆幼苗根部切片放入离心试管，在试管中分别加入二次水、CdTe、CdTe-JA偶合物及JA溶液，25 ℃恒温培养箱中黑暗条件下孵育1 h，然后用pH 7.4的PBS缓冲溶液离心洗涤3次. 取出幼苗切片，用荧光显微镜观察.

2 结果与讨论

2.1 CdTe/MA QDs合成条件优化及纯化

图1表明，反应原料Cd2+∶HTe-∶MA的摩尔比为1∶0.25∶2.4，反应的pH为5.50，100 ℃水浴条件下反应40 min为最优的反应条件.

异丙醇、乙醇、丙酮沉淀量子点时的纯化效果见图2，沉淀后的上清液均有荧光，说明有少量量子点没有被沉降，乙醇的沉降效果最差；将所得沉淀用等体积二次水溶回后，异丙醇为沉降剂获得溶液荧光强度最大，所以选择异丙醇为沉降剂；比较沉降前后量子点的荧光光谱(图2)，用异丙醇纯化后的量子点荧光发射峰位置没有改变，说明纯化过程没有导致因量子点的团聚引起的量子点粒径增大的现象；纯化后的量子点荧光强度保持了原有荧光强度75%，因为纯化过程中小粒径的量子点没有被沉淀，因而纯化后荧光强度下降.

当Tris-HCl缓冲溶液pH在5.8～8.0范围，量子点的荧光强度变化不大(图3)，考虑后续的偶联反应和生物体系常用的pH值为7.4，本实验用pH值为7.4的Tris-HCl缓冲溶液用于溶解分散量子点沉淀.

图2 不同溶剂对量子点荧光强度的影响

图3 不同pH Tris-HCl缓冲溶液对量子点荧光强度的影响

2.2 CdTe-JA偶合物的制备及表征

利用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为偶联剂，通过巯基乙胺修饰的CdTe量子点表面的氨基与茉莉酸(JA)的羧基进行缩合反应，得到CdTe-JA偶合物.

2.2.1 茉莉酮酸甲酯水解 茉莉酸甲酯水解后在3 500 cm-1处出现了茉莉酸的羧基中的-OH伸缩振动峰(图4)，在1 200 cm-1附近出现了很强的羧基的吸收峰，证明水解成功.

图4 茉莉酸甲酯和茉莉酸红外光谱

2.2.2 CdTe-JA偶合物制备条件优化 首先考察了原料配比JA∶NHS∶MA对CdTe-JA偶合物荧光强度的影响.按照氨基和羧基偶联反应的化学计量关系，JA与MA的摩尔比应该为1∶1，但按照最初合成量子点时MA加入量，在合成和纯化过程中并不是全部修饰在量子点上，同时修饰量子点表面的MA如果与大量的JA偶联， 粒子体积过大可能出现沉降. 优化实验表明，当JA∶NHS∶MA=1∶1∶3时，CdTe-JA偶合物荧光强度最大(图5A).

不同反应时间和反应温度对CdTe-JA偶合物荧光强度有一定影响，结果表明， 最佳的合成条件为:反应时间为30 min(图5B)、反应温度为37 ℃(图5C).不同pH值时CdTe量子点与JA的偶合反应见图5D，随着反应体系pH值的增大，CdTe-JA偶合物荧光强度逐渐增强，pH值大于8，偶合物荧光强度骤降，且偶合产物很不稳定，在pH 7.4时，偶合物荧光强度最强，主要是由于偶联反应适宜在中性条件下进行[10]，综合考虑偶联反应效率和后续生物应用，最佳的偶联条件是pH 7.4的近中性溶液体系.

图5 合成条件对CdTe-JA偶合物荧光强度的影响

2.2.3 CdTe-JA偶合物的吸收光谱 CdTe样在531 nm处有一较宽的吸收峰(图6)，偶联后CdTe-JA最大吸收峰位置移动到520 nm，说明CdTe与CdTe-JA为不同结构的物质，由此推断CdTe和茉莉酸发生了偶联作用.

图6 CdTe与JA偶联前后的可见光谱

图7 CdTe与JA偶联前后的红外光谱

2.3 CdTe-JA对绿豆幼苗中茉莉酸结合位点的荧光标记

绿豆幼苗经过CdTe-JA偶合物荧光标记后，在根部和下胚轴均有少量自发荧光，以根部的标记较明显(图8). JA不发荧光，孵育后的根部组织切片不出现明显的荧光信号，用CdTe量子点孵育的根部组织切片荧光与空白相比没有明显变化，这是因为CdTe没有特异性识别功能，缓冲液能将CdTe量子点洗涤掉. 与CdTe-JA偶合物孵育的绿豆幼苗根部看到明显的荧光，说明CdTe-JA对绿豆幼苗根部有标记效果.

图8 不同溶液与绿豆幼苗各部位孵育的荧光显微镜图(×100)

2.4 CdTe-JA偶合物抗光漂白实验

为了考察CdTe-JA偶合物的抗光漂白性，在蓝光持续照射下，用荧光显微镜每隔10 min拍照1次.连续照射1 h后，荧光基本没有变化，说明CdTe-JA的抗光漂白性好(图9).

图9 CdTe-JA偶合物标记的绿豆幼苗根部横截面荧光显微镜图(×100)

3 结论

合成和纯化了CdTe量子点，将CdTe量子点与JA偶联得到CdTe-JA偶合物，抗光漂白性好，可以标记绿豆幼苗根部的茉莉酸受体. 为生物标记及示踪等领域的应用提供方法.

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