IL—17在幽门螺杆菌不同亚型菌株感染AGS细胞中的表达

马振华　邹春燕

【摘要】 目的 探讨人白介素-17（IL-17）在幽门螺杆菌（HP）不同亚型菌株感染AGS细胞中的表达情况， 并探讨可能的作用机制。方法 采用酶联免疫吸附法（ELISA）法检测IL-17的表达， 并分析其与HP不同亚型间的关系。结果 HP I型与II型分别感染AGS细胞24 h、48 h后较空白对照组差异具有统计学意义（P<0.05）， HP I型与II型感染AGS细胞24 h后比较差异具有统计学意义（P<0.05）， HP I型与II型感染AGS细胞48 h后比较差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 HP不同亚型均可诱导IL-17的表达， 且HP I型更易诱导IL-17的表达。

【关键词】 幽门螺杆菌I型；幽门螺杆菌II型；AGS细胞；人白介素-17；酶联免疫吸附法

【Abstract】 Objective To investigate the expression of interleukin-17（IL-17） in AGS cells which infected by strains of helicobacter pylori（HP） in different subtypes and explore the possible mechanism. Methods By enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA） to detect the expression of IL-17， and to analyze its relationship with HP in different subtypes. Results HP type I and Type II infected AGS cells 24 h， 48 h and control group were significantly different（P<0.05）. There were obvious differences in 24 h after HP type I and type II infection in AGS cells， there were significant differences in comparison with 48 h after HP type I and type II infection in AGS cells（P<0.05）. Conclusion HP in different subtypes can induce the expression of IL-17， and type I can more easily induce the expression of IL-17.

【Key words】 Helicobacter pylori type I； Helicobacter pylori type II； AGS cells； Interleukin-17； Enzyme-linked immuno sorbent assay

幽门螺杆菌（HP）感染在慢性活动性胃炎、消化性溃疡及胃腺癌等各种胃肠道疾病中是一个至关重要的致病因素[1]。目前， 我国是HP感染率及胃癌的发病率最高的国家[2]。根据cag致病岛的有无， 将HP分为I型和II型， I型包含cag致病岛[3]。I型比II型更易诱导细胞形态的改变及更严重的炎症反应[4]。本研究利用I型和II型HP感染AGS细胞24 h， 48 h， 通过ELISA检测IL-17的浓度， 进而讨论HP不同分型对IL-17的诱导作用及机制。

1 资料与方法

1. 1 AGS细胞的培养 将AGS细胞（购买于中国科学院上海细胞研究所）接种至培养皿， 加入RPMI1640培养基， 放入37℃、5%CO2孵育箱培养。

1. 2 HP的培养 在微需氧环境下， HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株（美国ATCC公司）用哥伦比亚血琼脂选择培养基培养。

1. 3 HP不同菌株感染AGS细胞 HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株处于对数生长期时， 分别取少许菌液涂片， 用PBS溶液将处于对数生长期的HP I型HP5K菌株、II型HP26695菌株分别清洗2遍， 5000转， 离心5 min；分别制备HP悬液。

AGS细胞覆盖培养瓶底的80%时， 弃掉原培养基， 按细菌：细胞=100：1比例加入HP悬液， 放入37℃、5%CO2孵育箱共同培养24 h、48 h。

1. 4 ELISA

1. 4. 1 ELISA检测IL-17浓度 IL-17酶联免疫检测试剂盒购买自南京奥尼多福公司， 取出上述不同菌株感染的AGS细胞， 3000转， 离心20 min。收集细胞上清， ELISA检测IL-17浓度。具体操作步骤严格按照说明书进行。

1. 4. 2 待测样品浓度的计算 以OD值为纵坐标， 浓度为横坐标， 做出标准曲线并求出曲线方程， 然后根据待测样品的OD值在该曲线上求出相应的IL-17浓度， 再乘以稀释倍数5倍， 即待测样品的浓度。

1. 5 统计学方法 实验数据用SPSS19.0统计软件分析， 计量资料用均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验， 计数资料用率（%）表示， 采用χ2检验， P<0.05表示差异有统计学意义。采用Bartlett检验对各组数据进行方差齐性检验。若方差齐， 两个样本均数比较采用两样本t检验。若方差不齐， 则采用秩和检验。

2 结果

2. 1 HP不同亚型菌株感染AGS细胞24 h、48 h后诱导IL-17的表达与空白对照组比较 HP I型与II型分别感染AGS细胞24 h、48 h后较空白对照组差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 2 HP不同亚型菌株诱导IL-17的表达 24 h时HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS细胞所诱导IL-17浓度的比较， 差异有统计学意义（P<0.05）；48h时HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS细胞所诱导IL-17浓度的比较， 差异有统计学意义（P<0.05）；结果提示HP I型HPK5菌株诱导AGS细胞产生IL-17浓度大。见表2。

2. 3 HP同一亚型菌株感AGS细胞24 h、48 h后IL-17的表达 I型HP感染AGS细胞24 h、48 h后， IL-17浓度表达差异无统计学意义（P>0.05）； II型HP感染AGS细胞24 h、48 h后， IL-17浓度表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3 讨论

IL-17是重要的促炎性细胞因子， 其可诱导多种细胞释放炎症介质， IL-17不仅与炎性反应密切相关， 亦与自身免疫性疾病、消化道恶性肿瘤等相关[5]。研究表明， IL-17广泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多种肿瘤中。IL-17具有促进肿瘤发生发展的作用， 并可作用于肿瘤细胞及成纤维细胞等[6]。同时， 亦发现肿瘤所处的微环境可直接诱导IL-17细胞因子。IL-17可通过CXCL8因子促进中性粒细胞聚集， 此外， 中性粒细胞亦可通过CCL2和CCL20因子促进IL-17的产生。IL-17可以通过上调肿瘤细胞及基质细胞IL-6的表达量， IL-6作用于STAT3途径， 从而激活促癌基因的产生， 发挥延长细胞周期、抗凋亡、促进肿瘤血管生成[7]。

本研究结果显示HP不同亚型感染AGS细胞24 h、48 h后IL-17浓度表达量均较空白对照组表达量明显升高， 这与苏涛[8]等研究一致， 实验结果提示HP可诱导IL-17浓度表达， 从而加重炎症反应。本研究结果亦显示， I型HP感染AGS细胞后产生IL-17浓度大。此外， 大多数学者认为IL-17随肿瘤进展而增加， 且IL-17水平与肿瘤TNM分期正相关[9]， 但本实验结果示I型和II型HP均感染AGS细胞24 h、48 h后IL-17浓度表达无明显差异， 这与上述观点相悖， 有待进一步研究探讨， 明确是否随着时间的推移， IL-17浓度变化呈升高趋势。

综上所述， 在胃癌发生发展过程中， HP不同亚型菌株感染后所诱导IL-17的表达各不相同， 尤其I型HP是诱导IL-17浓度表达的重要因素， 充分探讨IL-17在胃癌中的作用及HP不同亚型诱导IL-17浓度表达的作用机制， 使IL-17可作为潜在治疗靶点， 以期为临床治疗与诊断提供新的思路。

参考文献

[1] Kusters JG， van Vliet AH， Kuipers EJ. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection. Clinic Microbiology Rev， 2006， 19（4）：449-490.

[2] Zhu YL， Zheng S， Du Q， et al. Characterization of Cag A variable region of Helicobacter pylori isolates from Chinese patients. World J Gastroenterol， 2005， 11（8）：880-884.

[3] Covacci A， Rappuoli R. Helieobacter pylori：after the genomes， back to biology. J Exp Med， 2003， 197（1）：807.

[4] Correa P， Piazuelo MB.Evolutionary History of the Helicobacter pylori “Genome：Implications for Gastric carcinogenesis”. Cut Liver， 2012， 6（1）：21-28.

[5] Su X， Ye J， Hsueh EC， et al.Tumor microenvironments direct the recruitment and expansion of human Th17 cells. J Immunol ， 2010（184）：1630-1641.

[6] Kuang DM， Peng C， Zhao Q， et al. Activated monocytes in peritumoral stroma of hepatocellular carcinoma promote expansion of memory T helper 17 cells. Hepatology， 2010， 51（1）：154-164.

[7] Pelletier M， Maggi Li， Micheletti A， et al. Evidence for a cross-talk between human neutrophils and Th17 cells. Blood， 2010， 45（115） 335-343.

[8] 苏涛. IL-17 在胃癌组织中的表达及临床意义. 第四军医大学， 2009.

[9] Maruyama T， Kono K， Mizukami Y， et al. Distribution of Th17 cells and FoxP3（+） regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes， tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer. Cancer Science， 2010， 8（101）：1947-1954.

[收稿日期：2014-05-21]

2. 2 HP不同亚型菌株诱导IL-17的表达 24 h时HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS细胞所诱导IL-17浓度的比较， 差异有统计学意义（P<0.05）；48h时HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS细胞所诱导IL-17浓度的比较， 差异有统计学意义（P<0.05）；结果提示HP I型HPK5菌株诱导AGS细胞产生IL-17浓度大。见表2。

2. 3 HP同一亚型菌株感AGS细胞24 h、48 h后IL-17的表达 I型HP感染AGS细胞24 h、48 h后， IL-17浓度表达差异无统计学意义（P>0.05）； II型HP感染AGS细胞24 h、48 h后， IL-17浓度表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3 讨论

IL-17是重要的促炎性细胞因子， 其可诱导多种细胞释放炎症介质， IL-17不仅与炎性反应密切相关， 亦与自身免疫性疾病、消化道恶性肿瘤等相关[5]。研究表明， IL-17广泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多种肿瘤中。IL-17具有促进肿瘤发生发展的作用， 并可作用于肿瘤细胞及成纤维细胞等[6]。同时， 亦发现肿瘤所处的微环境可直接诱导IL-17细胞因子。IL-17可通过CXCL8因子促进中性粒细胞聚集， 此外， 中性粒细胞亦可通过CCL2和CCL20因子促进IL-17的产生。IL-17可以通过上调肿瘤细胞及基质细胞IL-6的表达量， IL-6作用于STAT3途径， 从而激活促癌基因的产生， 发挥延长细胞周期、抗凋亡、促进肿瘤血管生成[7]。

本研究结果显示HP不同亚型感染AGS细胞24 h、48 h后IL-17浓度表达量均较空白对照组表达量明显升高， 这与苏涛[8]等研究一致， 实验结果提示HP可诱导IL-17浓度表达， 从而加重炎症反应。本研究结果亦显示， I型HP感染AGS细胞后产生IL-17浓度大。此外， 大多数学者认为IL-17随肿瘤进展而增加， 且IL-17水平与肿瘤TNM分期正相关[9]， 但本实验结果示I型和II型HP均感染AGS细胞24 h、48 h后IL-17浓度表达无明显差异， 这与上述观点相悖， 有待进一步研究探讨， 明确是否随着时间的推移， IL-17浓度变化呈升高趋势。

综上所述， 在胃癌发生发展过程中， HP不同亚型菌株感染后所诱导IL-17的表达各不相同， 尤其I型HP是诱导IL-17浓度表达的重要因素， 充分探讨IL-17在胃癌中的作用及HP不同亚型诱导IL-17浓度表达的作用机制， 使IL-17可作为潜在治疗靶点， 以期为临床治疗与诊断提供新的思路。

参考文献

[1] Kusters JG， van Vliet AH， Kuipers EJ. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection. Clinic Microbiology Rev， 2006， 19（4）：449-490.

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[3] Covacci A， Rappuoli R. Helieobacter pylori：after the genomes， back to biology. J Exp Med， 2003， 197（1）：807.

[4] Correa P， Piazuelo MB.Evolutionary History of the Helicobacter pylori “Genome：Implications for Gastric carcinogenesis”. Cut Liver， 2012， 6（1）：21-28.

[5] Su X， Ye J， Hsueh EC， et al.Tumor microenvironments direct the recruitment and expansion of human Th17 cells. J Immunol ， 2010（184）：1630-1641.

[6] Kuang DM， Peng C， Zhao Q， et al. Activated monocytes in peritumoral stroma of hepatocellular carcinoma promote expansion of memory T helper 17 cells. Hepatology， 2010， 51（1）：154-164.

[7] Pelletier M， Maggi Li， Micheletti A， et al. Evidence for a cross-talk between human neutrophils and Th17 cells. Blood， 2010， 45（115） 335-343.

[8] 苏涛. IL-17 在胃癌组织中的表达及临床意义. 第四军医大学， 2009.

[9] Maruyama T， Kono K， Mizukami Y， et al. Distribution of Th17 cells and FoxP3（+） regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes， tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer. Cancer Science， 2010， 8（101）：1947-1954.

[收稿日期：2014-05-21]

2. 2 HP不同亚型菌株诱导IL-17的表达 24 h时HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS细胞所诱导IL-17浓度的比较， 差异有统计学意义（P<0.05）；48h时HP I型HPK5菌株和II型HP26695菌株感染AGS细胞所诱导IL-17浓度的比较， 差异有统计学意义（P<0.05）；结果提示HP I型HPK5菌株诱导AGS细胞产生IL-17浓度大。见表2。

2. 3 HP同一亚型菌株感AGS细胞24 h、48 h后IL-17的表达 I型HP感染AGS细胞24 h、48 h后， IL-17浓度表达差异无统计学意义（P>0.05）； II型HP感染AGS细胞24 h、48 h后， IL-17浓度表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3 讨论

IL-17是重要的促炎性细胞因子， 其可诱导多种细胞释放炎症介质， IL-17不仅与炎性反应密切相关， 亦与自身免疫性疾病、消化道恶性肿瘤等相关[5]。研究表明， IL-17广泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多种肿瘤中。IL-17具有促进肿瘤发生发展的作用， 并可作用于肿瘤细胞及成纤维细胞等[6]。同时， 亦发现肿瘤所处的微环境可直接诱导IL-17细胞因子。IL-17可通过CXCL8因子促进中性粒细胞聚集， 此外， 中性粒细胞亦可通过CCL2和CCL20因子促进IL-17的产生。IL-17可以通过上调肿瘤细胞及基质细胞IL-6的表达量， IL-6作用于STAT3途径， 从而激活促癌基因的产生， 发挥延长细胞周期、抗凋亡、促进肿瘤血管生成[7]。

本研究结果显示HP不同亚型感染AGS细胞24 h、48 h后IL-17浓度表达量均较空白对照组表达量明显升高， 这与苏涛[8]等研究一致， 实验结果提示HP可诱导IL-17浓度表达， 从而加重炎症反应。本研究结果亦显示， I型HP感染AGS细胞后产生IL-17浓度大。此外， 大多数学者认为IL-17随肿瘤进展而增加， 且IL-17水平与肿瘤TNM分期正相关[9]， 但本实验结果示I型和II型HP均感染AGS细胞24 h、48 h后IL-17浓度表达无明显差异， 这与上述观点相悖， 有待进一步研究探讨， 明确是否随着时间的推移， IL-17浓度变化呈升高趋势。

综上所述， 在胃癌发生发展过程中， HP不同亚型菌株感染后所诱导IL-17的表达各不相同， 尤其I型HP是诱导IL-17浓度表达的重要因素， 充分探讨IL-17在胃癌中的作用及HP不同亚型诱导IL-17浓度表达的作用机制， 使IL-17可作为潜在治疗靶点， 以期为临床治疗与诊断提供新的思路。

参考文献

[1] Kusters JG， van Vliet AH， Kuipers EJ. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection. Clinic Microbiology Rev， 2006， 19（4）：449-490.

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[4] Correa P， Piazuelo MB.Evolutionary History of the Helicobacter pylori “Genome：Implications for Gastric carcinogenesis”. Cut Liver， 2012， 6（1）：21-28.

[5] Su X， Ye J， Hsueh EC， et al.Tumor microenvironments direct the recruitment and expansion of human Th17 cells. J Immunol ， 2010（184）：1630-1641.

[6] Kuang DM， Peng C， Zhao Q， et al. Activated monocytes in peritumoral stroma of hepatocellular carcinoma promote expansion of memory T helper 17 cells. Hepatology， 2010， 51（1）：154-164.

[7] Pelletier M， Maggi Li， Micheletti A， et al. Evidence for a cross-talk between human neutrophils and Th17 cells. Blood， 2010， 45（115） 335-343.

[8] 苏涛. IL-17 在胃癌组织中的表达及临床意义. 第四军医大学， 2009.

[9] Maruyama T， Kono K， Mizukami Y， et al. Distribution of Th17 cells and FoxP3（+） regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes， tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer. Cancer Science， 2010， 8（101）：1947-1954.

[收稿日期：2014-05-21]