基因芯片技术检测结核杆菌耐药的临床研究

孙炳奇，张 娟，孙 娇，孙秀华，赫心剑

(1.沈阳市胸科医院 结核病实验室，辽宁 沈阳110044；2.中国医科大学 生物科学与生物技术系97K41B，辽宁 沈阳110001)

近年来，结核分枝杆菌的耐药问题已成为全球关注的热点问题[1-3]，也是我国结核病防治工作中面临的挑战之一。长期以来，我国结核病实验室通常采用绝对浓度法或比例法进行结核杆菌药敏试验，这些方法尽管具有简单、经济等优势，但耗时较久，操作复杂，且结果不稳定，可重复性差，远不能满足临床诊治的需要。伴随着结核分枝杆菌耐药分子机制的阐明，通过检测耐药基因突变快速诊断耐药结核病的技术日益受到重视[4-6]。本研究采用基因芯片技术分别检测异烟肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RFP)的耐药情况，并与传统罗氏药敏结果进行对比，探讨其在药敏检测中的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1样本与试剂选取罗氏培养生长阳性菌株38例，包括8例INH和RPF均敏感菌株，18例耐多药菌株(INH和RFP均耐药)，6例单耐INH和6例单耐RFP菌株。晶芯 ExtractorTM核酸快速提取仪、PCR扩增仪、结核分枝杆菌耐药检测试剂盒(芯片法)、晶芯Biomixer芯片杂交仪、晶芯 SlideWasherTM芯片洗干仪和晶芯 LuxScan10K-B微阵列芯片扫描仪均由博奥生物有限公司生产。本研究已经过沈阳市胸科医院伦理委员会通过。

1.2罗氏药敏试验通过观察改良罗氏培养基上结核分枝杆菌菌落的生长速度、色泽等生物学性状，选取适当的菌落，按照《结核病诊断实验室检验规程》[7]，挑取培养基上菌落，用无菌0.5% 吐温80生理盐水溶解、稀释。与标准麦氏比浊管比浊，即制成1 g/L菌悬液，10倍稀释(连续两次)至10-2g/L，用灭菌吸管准确吸取0.1 ml菌液分别接种至对照及含药培养基斜面，每管接种量为10-3mg。异烟肼和利福平药物浓度分低高两种浓度，分别是0.2 mg/L、1 mg/L；50 mg/L、250 mg/L。

1.3样本制备及核酸提取取罗氏培养基上生长的结核分枝杆菌，用22SWG标准接种环收集细菌1环，并悬在250 μl 结核杆菌DNA提取液中。封口膜封口，99℃加热20 min，14 000 rpm离心10 min，转移上清到新的1.5 ml离心管，上清即为DNA模板。

1.4基因芯片技术检测向每管中分别加入同一样品的PCR对照产物和耐药基因扩增产物，并将混合物加热至95℃变性5 min，之后立即浸入冰水混合物中冰浴3 min。经盖片的加样孔加入13.5 μl杂交反应混合物，迅速盖上杂交盒并密封，每个微阵列限加一份相应的杂交反应混合物，然后放入晶芯Biomixer芯片杂交仪进行芯片反应，再将完成杂交的芯片放入晶芯SlideWasherTM芯片洗干仪中进行洗干，将洗干的芯片载入晶芯LuxScan10K-B微阵列芯片扫描仪中，自动进行结果判读。

1.5 与罗氏药敏结果不符的标本均进行测序验证，测序引物分别为INH-ahpC-seq-F:5'-CTTGCCGGAAAGACATGCC-3'，INH-ahpC-seq-R:5'-CGTCACTGGTGATAGTGGTG A-3'；INH-inhA-seq-F:5'-AGCGCGACATACCTGCTG-3'，INH-inhA-seq-R:5'-CCG ATCCC CCGGTTTCC-3'；INH-inhA94-seq-F:5'-CGTTTC ACATCGCACGGG-3'，INH-inhA94-seq- R:5'-GGCTCGGGTCGAAGTC-C-3'；INH-katG-seq-F:5'-CGAGACGTTTCGGCGC-3'，INH-katG-seq-R:5'-CCGTCCTTGGCGGTGT-3'；RFP-seq-F:5'-CGGGAGCGGATGACC AC-3'，RFP-seq-R:5'-GCG GTACGGCGTTTCGA-

T-3'。测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.6统计学分析实验数据采用SPSS13.0软件进行统计分析，两种方法检测结果的差异性应用配对四格表卡方检验判别(α=0.05)，两种方法检测结果的一致性用Kappa检验判别(Kappa≥0.75，两者一致性较好；0.75>Kappa≥0.4，两者一致性一般；Kappa<0.4，两者一致性较差)。

2 结果

罗氏培养药物敏感实验中只要低浓度管中结核杆菌生长即为对该种药物耐药。对INH检测的38例菌株中，32例与罗氏结果相符，总符合率84.2%，敏感度和特异度分别是75.0%和100.0%，两种方法无统计学显著性差异(P>0.05)，Kappa值为0.69，两种方法一致性一般；38例对RFP检测结果中，34例与罗氏结果相符，总符合率为89.5%，敏感度和特异度分别是91.7%和85.7%，两种方法无统计学显著性差异(P>0.05)，Kappa值为0.77，两种方法一致性较好。见表1和表2。

表1 基因芯片技术对异烟肼和利福平药物敏感性

表2 基因芯片检测耐药的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和к值

3 讨论

近年来，结核分枝杆菌耐药性呈逐年上升趋势[8]，异烟肼和利福平作为抗结核一线药物，其耐药性检测对于临床结核病药物治疗具有重要意义[9]。分子诊断技术是近年来开发运用于结核病耐药基因的热点技术[10，11]，可以通过检测结核分枝杆菌耐药基因的位点突变来预测表型耐药，从而快速准确地检测结核杆菌耐药性。基因芯片技术作为一种高通量自动化检测技术，在病原微生物分子诊断方面可用于病原体菌种鉴定、分型、鉴别、诊断、耐药性检测等多个领域，具有快速、准确、高通量、自动化程度高等优点，成为近年来研究的热点。本研究将其用于异烟肼和利福平耐药检测，结果显示与罗氏培养结果的符合率分别为84.2%和89.5%，敏感度为75.0%和91.7%，特异度为100.0%和85.7%。此方法与罗氏药敏检测结果一致性较好，并且操作简便，检测快速，符合临床的需要，虽然受限于其自身耐药基因突变的特点而无法检出所有的耐药结核分枝杆菌，但对于快速筛查结核分枝杆菌耐药突变以及制定相应的治疗方案，从而降低耐药菌株在人群中的传播均有十分积极的意义。

本研究应用基因芯片方法对38例样本进行异烟肼耐药基因突变检测中，同罗氏药物敏感试验相比共有6例检测结果不同，均为罗氏药物敏感试验结果为耐药而基因芯片检测结果为敏感，这可能与基因芯片检测位点有限(检测katG和InhA基因相关位点)，未能涵盖所有引起耐药的突变位点有关。而基因芯片对38例菌株利福平耐药性的检测结果有4例与罗氏不同，其中2例为罗氏药物敏感试验结果为耐药而基因芯片检测结果为敏感，可能与基因芯片RFP检测位点外其它位点的突变从而引起耐药有关；另2例为罗氏药物敏感试验结果为敏感而基因芯片检测结果为耐药，后经测序证明为突变菌株，考虑可能系耐药基因出现无义突变，造成分子生物学诊断与表型耐药结果不一致；也有可能与罗氏药敏培养基中药物经加热后造成药物活性下降有关。

在检测RFP耐药试验中，基因芯片与罗氏药物敏感试验两种方法的一致性较好(Kappa值0.77)；在检测INH耐药试验中，基因芯片与罗氏药物敏感试验两种方法的一致性一般(Kappa值0.69)。这与文献报道中， KatG和InhA基因位点突变引起的INH耐药只占总INH耐药的70%，而rpoB基因位点突变引起的RFP耐药占总RFP耐药的90%是一致的。另外，在INH和RFP耐药检测中，在两种方法均无统计学显著性差异。

与传统药敏试验相比，基因芯片技术在应用于结核分枝杆菌耐药的快速检测时有较高的阳性检出能力，有着良好的特异度和灵敏度，同时更加简便、快速，能为临床耐药结核病的筛查与防治提供良好的技术支持[12]，对临床及时准确进行抗结核治疗具有重要意义。但是分子生物学检测手段多需要特殊仪器及相关的软件分析系统，检测成本较高，这也在一定程度上限制了其在基层医院的推广应用。

作者简介：孙炳奇(1976-)，男，硕士，副主任检验师，主要从事结核菌快速检测和耐药机制的研究工作。

参考文献：

[1]Yu CC，Chang CY，Liu CE ，et al.Drug resistance pat tern of Mycobacterium tuberculosis complex at a medical center in central Taiwan[J].Microbiol Immunol Infect，2010，43(4):285.

[2]Gumbo T.New susceptibility breakpoint s for first line antituberculosis drugs based on antimicrobial pharmacokinetic/pharmacodynamic science and population pharmacokinetic variability[J].Antimicrob Agents Chemother，2010，54(4):1484.

[3]Li GL，Zhao DF，Xie T，et al.Molecular characterization of drug-resistant Beijing family isolates of Mycobacterium tuberculosis f rom Tianjin，China [J].Biomed Environ Sci，2010，23(3):188.

[4]Kim SY，Park YJ，Song E，et al．Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis[J]．Diagn Microbiol Infect Dis，2006，54:203.

[5]Park H，Song EJ，Song ES，et al．Comparison of a conventional antimicrobial susceptibility assay to an oligonucleotide chip system for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates[J]．Clin Microbiol，2006，44:1619.

[6]Guo Y，Zhou Y，Wang C，et al．Rapid，accurate determination of multidrug resistance in M．tuberculosis isolates and sputum using a biochip system[J]．Int Tuberc Lung Dis，2009，13:914.

[7]中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程[M].北京：中国教育文化出版社,2006;54,56-57.

[8]Hu Y，Hoffner S，Jiang W，et al.Genetic characterisation of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis in rural China:a population2based study[J].Int Tuberc Lung Dis，2010，14(2):210.

[9]Cade CE，Dlouhy AC，Medzihradszky KF，et al.Isoniazid-resistance conferring mutations in Mycobacterium tuberculosis Kat G:catalase，peroxidase，and INH-NADH adduct formation activities[J].Protein Sci,2010，19(3):458.

[10]Bravo LT，Tuohy MJ，Ang C，et al.Pyrosequencing for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis resistance to rifampin，isoniazid，and fluoroquinolones[J].Clin Microbiol，2009，47:3985.

[11]Pietzka AT，Indra A，Stoger A，et al.Rapid identification of multigrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates by rpoB gene scanning using high-resolution melting curve PCR analysis[J].Antimicrob Chemother[J]，2009，63:1121.

[12]张立群，王云霞，周 敏,等.4种不同结核分枝杆菌检测方法对结核病的诊断价值比较[J]．中华医院感染学杂志 2010,11:1633.