GDNF基因诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究

顾加祥，尚修超，刘宏君，张乃臣，田 恒，潘俊博，杨建东*

(1.扬州大学临床医学院 手外科，江苏 扬州225001；2.扬州大学医学院,江苏 扬州225001)

胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)，不仅可促进多种神经元的存活与分化,而且对多种原因造成的神经损伤具有明显的保护作用[1]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)又名骨髓基质干细胞，是来源于骨髓的单胚层多能干细胞，能自我增殖。一方面，通过分泌多种细胞因子和生长因子控制造血干细胞的成熟和分化。另一方面，具有横向分化的潜能，如：神经细胞、骨细胞、软骨细胞、心肌细胞及肝细胞等。因其取材容易，能迅速体外培育和增殖，同时具有多向分化潜能，并且避免了伦理方面的冲突。因此，骨髓间充质干细胞在组织工程、细胞移植和基因治疗方面有十分广阔的前景[2,3]。

1 材料与方法

1.1 试剂

SD大鼠(扬州大学医学院动物房提供)，脂质体(美国invitrogen) ，GDNF基因(美国abcam公司)，DAPI(福建迈新)，NSE一抗 (美国abcam)，MAP-2一抗(美国abcam公司)，免疫红色荧光二抗(北京博奥森)，倒置显微镜(日本nikon)。

1.2 BMSCs的分离培养与鉴定

成年大鼠由我校动物实验中心提供，体重180 g左右。将大鼠置于75%的酒精中消毒5 min。无菌条件下取出双侧胫骨和股骨，并剪去两端，用5 ml注射器抽取DMEN培养基5 ml反复冲洗骨髓腔，将冲洗液缓慢置于离心管中,2 500 r/min离心20 min,收集中间单层细胞,PBS 冲洗2次,应用含10%胎牛血清的DMEM培养基3 ml 重新悬浮细胞,接种于6孔板内,置于室温、5% CO2、饱和湿度下常规培养。24 h后更换新培养液去除非贴壁细胞,以后每隔3 d换液一次。当10-12 d时，细胞生长融合达培养板孔90% ，用0.25%胰蛋白酶消化传代,3-4 d传代一次。用倒置相差显微镜观察细胞生长情况。

BMSCs传至第三代时收集细胞,PBS 洗涤2次,加入荧光标记抗体避光4℃孵育30 min,PBS 洗涤2次。

1.3 GDNF基因脂质体转染

在转染前一天将BMSCs细胞按5×104cells/ml接种于6孔培养板;脂质体、载GDNF的质粒转染细胞，于室温、5%CO2、饱和湿度下的培养箱中培养3 d。分别于GDNF基因作用6 h、24 h、48 h及72 h后,在倒置相差荧光显微镜下观察脂质体转染情况。可见24 h转染效率较佳，镜下观察明显可见细胞荧光，表明转染结果达到要求。

1.4 免疫荧光检测

将诱导后的BMSCs种植在24孔板内(板内放置无菌玻片)，对细胞行NSE、MAP-2 免疫荧光染色检测，一抗为兔抗NSE(1∶100)、兔抗MAP-2(1∶100)，4℃孵育过夜；二抗为生物素化羊抗兔IgG(1∶100)，室温孵育1 h，SABC-Cy3液(1∶100)，室温孵育30 min。NSE、MAP-2阳性细胞呈红色荧光。

2 结果

镜下观察可见三代细胞形态舒展，贴壁佳，达到转染前良好的细胞状态。

GDNF基因脂质体转染24小时，镜下白光可见转染后24小时细胞贴壁及舒展状态良好(图1)，镜下绿色荧光可见细胞荧光强度佳，转染效率达到诱导要求(图2)。

免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性显示(图3)，髓磷脂酸性蛋白2(MAP-2)高表达(图4)。充分说明了诱导后的骨髓间充质干细胞已经表现出神经细胞的特性。

图1转染后BMSCs白光 图2 转染后BMSCs荧光 图3GDNF基因诱导后2周 图4 GDNF基因诱导后2周NSE免疫荧光染色后MAP-2免疫荧光染色

3 讨论

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于中胚层的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，具有自我更新和增殖能力，在适宜的微环境里具有多向分化潜能[4,5]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs),作为供体细胞具有胚胎干细胞和神经干细胞所无法比拟的优点:可以很容易地从成人体内获得骨髓细胞,并且对成人损害轻微;自体移植克服了使用胎儿组织所带来的伦理和免疫学方面的问题。BMSCs向神经细胞转化主要通过以下通路进行：①Wnt信号通路；②Notch信号通路；③Erk信号通路；④蛋白激酶A信号通路[6,7]。同时，microRNAs的表达在神经系统发育中起着重要的调控作用，它通过转录水平、转录后水平和表观遗传学水平等方式调控基因的表达，使得蛋白质特异性表达，从而在神经分化和神经系统疾病中发挥重要作用[8]。

胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)对多巴胺能神经元、运动神经元等多种神经元均具有促存活及损伤保护作用，对感觉神经元有营养作用，因此其可应用于神经损伤和神经退行性疾病的治疗[9,10]。

通过贴壁筛选法从成年大鼠骨髓中成功分离得到BMSCs，并通过3次传代在体外进行纯化。GDNF基因脂质体转染后，BMSCs具有神经细胞的特有形态：胞体呈双极或多极型，伸出较多突起和分支，形成网络。

通过不同时间点对神经细胞不同发育阶段的蛋白表达水平的检测，我们发现NSE和MAP-2依次表达，这与神经干细胞向神经元分化的过程相符。

神经元特异性烯醇化酶(NSE),对维持神经系统生理功能极为重要，被认为是神经元和神经内分泌细胞的标志物。实验中可见NSE表达，且含量随着时间延长而增加[11-13]。髓磷脂酸性蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP-2)为神经细胞骨架成分，主要在神经元胞体、树突、树突棘表达，是一种调节微管蛋白组装和动力学的重要调节因子，与微管蛋白形成微管，并和其他结构元件构成细胞骨架成分，参与突起生长、胞浆蛋白运输、线粒体的轴突转运、神经元和突触可塑性调节等功能，可作为神经元的标志蛋白。实验中，发现MAP-2的表达随着时间的延长，其表达量逐渐增加[14,15]。

现今急需解决的问题是如何有效的将外源基因导入靶细胞并使其稳定表达。目前用于介导GDNF基因的载体很多，如慢病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体[16-18]。脂质体用于脱氧核苷酸的介导已有一段时间，尚未用于GDNF基因的介导[19-21]。我们采用GDNF基因脂质体转染的方法诱导BMSCs向神经元细胞分化。

虽然BMSCs可向神经细胞分化，但BMSCs在诱导分化过程中仍有不足之处[22-26]：①没有BMSCs的特异性标记分子，而且没有标准的分离纯化、培养扩增和鉴定的方法；②BMSCs诱导分化效率尚不理想，如何定向诱导BMSCs向单一的特定的细胞分化仍在研究之中；③BMSCs可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞，但诱导后的细胞是否具有神经细胞的生理功能尚待进一步研究。

同时，我们应对BMSCs诱导分化后的神经细胞内是否含有神经递质进行检测：①该物质是否存在于轴突末梢内;②神经兴奋时该物质是否能释放至突触间隙，并且作用于突触后膜上的特异性受体；③神经元中是否有合成该物质的前体和中间物，是否有合成酶和分解酶；④神经末梢内是否有对该物质迅速灭活的机制系统；⑤该物质作用于突触后膜时是否能模拟神经生理效应；⑥该物质是否有特异性阻断剂。

作者简介：顾加祥(1969-)，男，医学博士，副教授，硕士生导师，研究方向：手足显微外科。

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