兔脂肪间充质干细胞向胰岛素样分泌细胞分化及鉴定

郭 伟,孙 昱，杨海山

(吉林大学白求恩医学部中日联谊医院 放射线科,吉林 长春130033)

脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)最早由Zuk[1]等人于2001年从抽脂术中抽取的脂肪组织中分离培养，近年来已成为医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点。ADSCs是一种来源于脂肪组织中的多能干细胞，和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 类似，也有很强的增殖能力和分化潜能。ADSCs能在不同的诱导微环境下向不同的组织细胞(如脂肪细胞、成骨细胞、内皮细胞、心肌细胞和神经细胞等) 分化[1]。本实验在体外分离培养兔的脂肪间充质干细胞，通过相应的试剂使其诱导分化为类胰岛素分泌细胞，并研究其生物学特性，以期为临床采用ADSCs治疗Ⅰ型糖尿病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级新西兰大白兔3只，2.0-2.5 kg，雄性，购自吉林大学实验动物中心，实验过程中对实验动物的处置符合《实验动物管理条例》要求。

1.2 ADSCs的分离培养

将新西兰大白兔以2 ml/kg标准，用浓度为1.5%的戊巴比妥经耳缘静脉注射麻醉，无菌条件下获取其腹股沟部位的脂肪组织，然后仔细清除脂肪外包被的筋膜及血管，用含双抗的PBS反复冲洗多次，并将其剪碎成糊状，再加入适量的0.15%Ⅰ型胶原酶，于37℃水浴恒温摇床消化30-50 min。然后将其用100目筛网过滤，滤液以1 200 r/min离心5 min，弃去上层的脂肪滴及上清，将底部的沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培养液重新悬浮，然后接种于培养瓶中。24小时后首次更换培养液，以后每三天更换一次。当贴壁细胞长满瓶底壁面积的70%-80%后用0.25%的胰蛋白酶消化，以1∶2或1∶3比例传代。

1.3 绘制细胞生长曲线

采用MTT法绘制ADSCs生长曲线：分别取第3、5、10代的ADSCs，以1×104/mL的密度分别接种于96孔培养板内，每孔200 μl；每天同一时间，每组各取3孔细胞，每孔加入5%四唑盐(MTT)20 μl，孵育4小时后弃去孔内液体；用培养液洗两次后分别加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，轻微震荡20 min后用酶标仪测定波长490 nm处各孔的吸光度(OD)。以3个平行样品的平均值为纵坐标，以时间 (d) 为横坐标，来绘制细胞生长曲线。

1.4 ADSCs向胰岛素分泌细胞诱导分化并进行双硫腙染色鉴定

取第三代脂肪间充质干细胞，以1×105/mL的密度接种于6孔板中，先用原有的无血清培养液于37℃，5%CO2条件下孵育12 h后，撤去上述培养液，然后根据实验目的将培养的细胞分为对照组和诱导组分别培养。其中对照组只用单纯的高糖DMEM进行培养，诱导组将分三个阶段逐步进行诱导分化：(1)加入含有1 mmol/L 2-巯基乙醇、2 mmol/L 谷氨酰胺的高糖DMEM，培养2天；(2)加入含有10 μg/L 碱性成纤维生长因子、2% B27、10 μg/L 表皮生长因子、2 mmol/L 谷氨酰胺的高糖DMEM，培养6天；(3)加入含20 mmol/L 尼克酰胺、100 nmol/L胰高血糖素样肽-1(glucagons-like peptide-1，GLP-1)、1 mmol/L 2-巯基乙醇的高糖DMEM，培养6天，并于相差显微镜下观察各阶段细胞的形态变化。然后分别取对照组和诱导组14 d的细胞爬片，再用0.1 mg/ml的双硫腙溶液(将50 mg双硫腙加入5 ml DMSO溶解作为储备液，使用时取0.1 ml加入10 ml PBS中，将其抽滤后作为染色液)进行染色，于37℃下孵育15 min后，于倒置显微镜下观察两组细胞的着色情况。

1.5 葡萄糖刺激胰岛素释放试验

取第三代脂肪间充质干细胞，以2×105/mL的密度接种于24孔板中，每孔细胞数量为1×105个，将其分为空白对照组、低糖刺激组和高糖刺激组。对照组为未诱导的脂肪间充质干细胞。低糖刺激组和高糖刺激组以上述方法进行诱导，并于诱导后第7天、14天和21天时，每组各取8个培养孔，分别加入低糖DMEM(10.0 mmol/L)和高糖DMEM(30.0 mmol/L)培养液0.5 ml，继续培养24 h后，收集24孔板中的上清液，用Insulin-ELISA试剂盒检测其胰岛素含量。同时检测对照组的细胞培养液，将其作为阴性对照。

1.6 ADSCs表面抗原标志检测

取第三代脂肪间充质干细胞，先用0.25%的胰蛋白酶消化10 min，PBS冲洗3遍，离心后的沉淀用500 μL Binding Buffer缓冲液悬浮，然后分别与5 μL CD29-FITC，CD44-FITC，CD45-FITC，CD80-FITC室温下避光孵育30 min，再用流式细胞仪检测CD29，CD44，CD45，CD80的表达。

1.7 统计学方法

用SPSS 14.0软件对数据进行统计，组间比较采用Student’st检验方法进行统计学分析。结果以Mean±S.D.表示，P<0.05表示结果具有显著性差异。

2 结果

2.1 ADSCs的细胞形态

原代培养的兔ADSCs12小时开始逐渐贴壁，24小时完成贴壁， 其形态多呈短梭形或多角形。瓶内悬浮的球形或圆形的未贴壁细胞多为未除尽的血细胞，其在第一次更换培养液时即可除去。随着培养时间延长，贴壁的细胞数量逐渐增多，形态变为长梭形，呈团簇状生长，逐渐形成细胞集落(图1)。第一代传代细胞约2-4小时开始贴壁，12小时后开始快速增殖，约3天即可长满培养瓶底壁(图2)。实验观察结果显示，兔的ADSCs可连续传多代而保持原有的细胞形态和活力，适合作为组织工程的种子细胞。

图1 原代培养的兔ADSCs(×200倍)

图2 传代培养的兔ADSCs(×200倍)

2.2 ADSCs的生长曲线分析

结果显示，多代ADSCs的生长曲线形态相似(图3)，都于第3天进入对数生长期，第6天时达到峰值，约从第7天开始进入平台期，呈典型的“S”形细胞成长曲线。说明兔ADSCs具有相对稳定的遗传特性。

图3 ADSCs的生长曲线

2.3 ADSCs向胰岛素分泌细胞的分化

显微镜下观察显示，在诱导分化过程中的第一阶段ADSCs细胞形态无明显变化；第二阶段细胞形态变椭圆，且折光度增强；到第三阶段时细胞周边突触逐渐缩短，中心渐变圆，14天时可见半悬浮的胰岛样细胞团。诱导14天时的双硫腙染色结果显示：对照组细胞不着色；诱导组的细胞染色后呈棕红色(图4)，证明该细胞团中有胰岛素成分。

2.4 葡萄糖刺激胰岛素释放试验结果

图4 14天时ADSCs的双硫腙染色结果

兔ADSCs诱导后第7天时低糖刺激组和高糖刺激组胰岛素表达均为阴性；第14天培养液中可以检测到胰岛素分泌，低糖刺激组胰岛素分泌量为13.2±2.1 μIU/ml，高糖刺激组其值为14.1±1.7 μIU/ml，两组之间无显著性差异(t=1.622，P>0.05)；第21天时两组胰岛素浓度较第14天时均增高，其中低糖刺激组为17.1±2.2 μIU/ml，高糖刺激组为20.7±1.8 μIU/ml，两组之间有显著性差异(t=6.847，P<0.05)。空白对照组均未检测出胰岛素。

2.5 ADSCs表面标志检测结果

结果(图5)可见，CD29和CD44表达阳性，阳性率分别为99.98%和98.88%，而CD45和CD80表达阴性，检出率分别为1.32%和2.32%。

图5 ADSCs的表面标志的流式检测结果

3 讨论

本实验选用了以尼克酰胺和GLP-1为主要试剂的诱导方案，将ADSCs诱导分化为胰岛素样分泌细胞。其中尼克酰胺是一种ADP-核糖合成酶抑制剂，能促进内分泌细胞的分化，其主要是通过它的代谢产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)起作用。有研究表明尼克酰胺还可以促进干细胞的分化，促进胰岛素分泌细胞的生成[2,3]。此外，尼克酰胺还能增加胚胎干细胞(ESCs)分化成胰岛素分泌细胞的数量[4]。GLP-1是小肠L细胞分泌的一种肠降血糖素。它能刺激胰腺β细胞的分化和增殖，抑制β细胞凋亡[5]，增加胰岛β细胞的数量，从而促进胰岛素的分泌。体外研究表明，GLP-1还可以诱导骨髓干细胞[6]、nestin阳性的胰岛源性干细胞[7]，使其分化为胰岛素分泌细胞并分泌胰岛素。

双硫腙可与多种重金属离子(锌、镉、铅等)形成螯合物，是测定重金属离子浓度的高灵敏试剂。胰岛细胞由于含有锌离子，能与双硫腙螯合形成紫红色的络合物，呈阳性反应，因此可以用双硫腙染色来鉴定胰岛细胞[8]。在本实验中，经过诱导14天后的ADSCs，培养瓶内的细胞团能够被双硫腙特异染色，说明该经过诱导14天后的ADSCs有细胞分化为胰岛细胞。而且葡萄糖刺激胰岛素释放试验阳性，说明ADSCs诱导分化的胰岛素样细胞可以分泌胰岛素，并且随着葡萄糖浓度的增加，其分泌量也明显增加，证明ADSCs诱导后的胰岛素样细胞对糖刺激敏感，其胰岛素的分泌受到外部环境中糖浓度的影响。实验表明，诱导后的ADSCs具有类似体内胰岛细胞的功能，并通过血糖变化调节胰岛素分泌。

本实验探讨了CD29、CD44、CD45、CD80等相关表面抗原分子在ADSCs上的表达及其意义。CD29作为整合素家族之一，能介导细胞与细胞外基质黏附，参与免疫细胞黏附，为T细胞活化提供协同刺激信号；CD44是基质细胞表面抗原；CD45是造血干细胞表面标志[9]；CD80，即B7-1，是一种重要的共刺激分子，表达在活化B细胞及其他APC表面，是T细胞表面CD28分子和细胞毒性T细胞相关抗原-4(CTLA-4)的配体，具有协同刺激分子的作用。本实验中，用流式细胞仪检测ADSCs表面的抗原标志物的表达，结果显示CD29、CD44高表达，CD45、CD80表达呈阴性，与文献报道相一致[10,11]。ADSCs高表达CD44，而不表达CD45说明ADSCs来自于基质细胞，而非血液循环中的造血干细胞，这也与其组织来源相吻合。

与干细胞的其他来源组织相比较，脂肪间充质干细胞易于体外培养，且可抑制免疫排斥反应，是一种适合的组织工程种子细胞。本实验证明脂肪间充质干细胞还能诱导分化为类胰岛素分泌细胞，发挥胰岛素降血糖的作用，这为今后脂肪间充质干细胞用于Ⅰ型糖尿病的治疗提供了理论依据。

作者简介：郭伟(1981-)，男，在读医学博士，主要从事脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化研究。

参考文献：

[1]Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell,2002,13(12):4279.

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[4]Vaca P,Bernat G,Martin F,et al.Nicotinamide induces differentiation of embryonic stem cells into insulin-secreting cells[J].Transplantation Proceedings,2003,35(5):2021.

[5]Brubaker PL,Drucker DJ.Glucagon-like peptides regulate cell proliferation and apoptosis in the pancreas,gut and central nervous system[J].Endocrinology,2004,145(6):2653.

[6]Tang DQ,Gao LZ,Brant R,et al.In vivo and in vitro characterization of insulin-producing cells obtained from murine bone marrow[J].Diabetes,2004,53(7):1712.

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[8]孙 昱,王文加,杨海山,等.兔脂肪间充质干细胞胰岛素分泌功能的体外诱导[J].中国生物制品学杂志,2008,05:378.

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