BAPTA-AM脂质体抗大鼠急性肾损伤作用

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(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)是由各种原因引起肾功能在短时间内急剧恶化，水、电解质及酸碱平衡失调，患者出现少尿甚至无尿及急性尿毒症等症状的临床综合征.目前临床上尚无明显降低其高死亡率的临床药物和治疗方案，临床上尽管有包括肾移植在内的支持疗法，但是AKI的病死率依然高达60%[1-2].AKI的发病机制十分复杂，诱因诸多，如肾小管上皮细胞凋亡、肾小管功能障碍、局部微血管血液流动障碍等[3-4].细胞内Ca2+失衡是造成AKI的重要因素之一[5-6].体外研究表明：夹紧肾蒂45 min引起肾脏缺血会使内质网钙摄取减少，细胞内钙超载导致线粒体损伤，合成ATP能力受损，快速引起细胞死亡[7-8].若大量的肾小管上皮细胞死亡，将引起肾小管阻塞，AKI发生.BAPTA-AM一种快速高效的细胞内Ca2+络合剂，一旦进入细胞可以水解成BAPTA，从而与Ca2+发生一系列复杂的反应，控制细胞内钙水平，消除钙超载，对钙超载、氧化引起的细胞损伤有明显的保护作用[9].宋必卫课题组已发现：BAPTA-AM能减轻D-氨基半乳糖(D-GalN)诱导的MDCK细胞损伤及对多种损伤细胞均有保护作用[10-13].因此，本研究通过建立大鼠实验性缺血性AKI模型，观察BAPTA-AM脂质体(BA-L)抗AKI作用及机制.

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

BA-L由合肥恒星科技公司提供；肌酐试剂盒(Cr,批号20130524)、尿素氮试剂盒(BUN,批号20130510)、乳酸脱氢酶试剂盒(LDH,批号20130710)、丙二醛试剂盒(MDA,批号20130421)、超氧化物歧化酶试剂盒(SOD,批号20130523)、考马斯亮蓝试剂盒(批号20130416)均购自南京建成生物工程研究所；大鼠胱抑素C检测试剂盒(Cys C,批号20130620TY)购自上海朗顿生物技术有限公司.

1.2 实验动物

雄性健康清洁级SD大鼠，体重200～220 g，由浙江省医学科学院动物中心提供，许可证号：scxk(浙)20080033.

1.3 分组与给药

大鼠随机分为正常组，假手术组，模型组，BA-L 3个剂量给药组(剂量分别为50，100，200 μg/kg)每组8只.再灌注开始后立即尾静脉注射相应剂量BA-L，与此同时正常组、假手术组和模型组分别给予等量生理盐水.

1.4 大鼠急性肾损伤模型的制备

实验前大鼠禁食12 h，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，沿腹正中线纵切口打开腹腔，暴露左右两肾，分离肾动、静脉及输尿管，用无创动脉钳夹闭双侧肾动脉，肾脏颜色由鲜红转为苍白或暗红色，45 min后松开动脉钳恢复灌注，10 min内肾脏再变成鲜红色，表明急性肾损伤模型建立成功，否则剔出实验[14-15]，检查创面无出血现象后逐层缝合关闭腹腔，假手术组仅分离但不夹闭双侧肾动脉.

1.5 大鼠血液和组织样本的采集

再灌注24 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，颈总动脉取血，3 000 r/min离心10 min，取血清分装保存，用于检测血清Cr,BUN,Cys C,LDH水平.取血后立即取左肾，置于冰盐水中，洗净表面血液，取肾组织上极以PBS为介质制备10%组织匀浆，用于检测组织MDA含量和SOD活性.

1.6 肾脏病理学改变

取相同部位肾组织，10%福尔马林溶液固定至少24 h，常规石蜡包埋，制成厚度为4 μm的切片，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，HE染色，400倍光镜下观察肾组织病理学改变，随机选取5个视野，每个视野选择10个肾小管进行评分，根据Paller’s法计算50个肾小管得分，用于评价肾小管损伤程度(得分越高损伤越严重)[16]：肾小管明显扩张、细胞扁平(1分)；间质水肿(1分)；刷状缘脱落分级(1分)；细胞质空泡形成(1分)；细胞膜泡的形成(2分)；肾小管腔梗阻(2分).

1.7 统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0软件处理数据，数据用Mean±S.E.M表示，实验所得数据均采用One-way ANOVA检验均数差异显著性，以P<0.05为差异有显著性意义.

2 结 果

2.1 BA-L对AKI大鼠血液生化指标的影响

血清Cr，BUN，Cys C和LDH水平见图1.假手术组与正常对照组相比各指标均无显著性差异.模型组血清Cr显著升高(P<0.001)，提示肾小球功能损伤显著.不同剂量BA-L治疗组可降低血清Cr水平(P<0.001).同样地，模型组血清BUN水平明显增加(P<0.001)，而BA-L呈剂量依赖性降低血清BUN水平，当BA-L剂量为100 μg/kg效果最佳(P<0.01)，进一步增大剂量至200 μg/kg时作用减弱.Cys C是半胱氨酸蛋白酶抑制剂之一，它是由所有有核生物以恒定速率产生.最近的研究表明，血清Cys C能比Cr更敏感且快速地检测急性肾功能改变[17].模型组血清Cys C水平急剧升高(P<0.001)，给予50 μg/kg BA-L治疗时Cys C水平有一定程度的降低(P<0.05)，进一步增大剂量(100和200 μg/kg)可显著降低Cys C水平(P<0.001).LDH是细胞破裂的非特异性标志物，已证明其在AKI再灌注过程中释放[18]，是肾坏死的指标.与对照组比较，模型组LDH水平显著提高(P<0.001)，各剂量BA-L治疗组能显著抑制LDH释放(P<0.001).综上所述，100 μg/kg时BA-L效果最佳，加大剂量药效反而减弱，提示BA-L治疗存在最适剂量.

与正常对照组相比，###为P<0.001；与模型组相比，*为P<0.05,***为P<0.001

2.2 BA-L减轻AKI大鼠肾组织氧化损伤

肾组织MDA含量和SOD活性见表1.模型组SOD活性明显降低(P<0.001)，同时MDA含量显著增加(P<0.001).给予BA-L治疗时能明显改善肾功能水平，显著降低MDA含量(P<0.001)，恢复SOD活性.当BA-L剂量过低(50 μg/kg)或过高(200 μg/kg)作用均减弱.结果表明：BA-L可能是部分通过抗氧化损伤从而发挥了保护肾脏的作用，并且呈现一定的剂量依赖性.

表1 BA-L对AKI大鼠肾组织氧化损伤、Paller’s法评分结果的影响1)

2.3 BA-L改善AKI大鼠肾脏病理学变化

综合上述实验结果，选取BA-L 100 μg/kg组进行HE染色，光镜下400倍观察大鼠肾脏病理学变化(图2).正常组和假手术组肾组织形态完整(图2a，b)，而模型组大鼠肾组织出现严重的急性肾小管损伤(图2c)，肾小管扩张，上皮细胞肿胀核固缩以及中度至重度的坏死.BA-L治疗组肾组织形态结构基本正常，肾小管细胞轻度水肿(图2d).Paller’s法评分(表1)表明：模型组得分与对照组相比明显增高，肾小管损伤程度严重；而BA-L治疗组得分较模型组显著降低，肾小管损伤减轻.

图2 BA-L改善AKI大鼠肾脏病理学变化

3 讨 论

肾脏缺血再灌注(I/R)引起的AKI在临床上十分常见，临床上多种原因均可导致急性肾缺血再灌注损伤，如肾移植、心跳骤停、休克、严重感染等，目前尚无有效的治疗方法.I/R引起的AKI以肾功能障碍，肾小管、肾小球损伤，肾小管细胞凋亡为其主要病理特征.细胞内钙超载是导致缺血性AKI的重要触发点之一.BAPTA-AM是易渗透入细胞的Ca2+螯合剂，一旦进入细胞，可以通过脂肪酶水解成BAPTA，从而控制细胞内钙水平，消除钙超载.本课题组前期已证实该药对D-GlaN诱导的MDCK细胞损伤有较强的抵抗作用，显著减少细胞死亡[10].在此基础上，本实验建立急性肾缺血再灌注损伤模型，进一步探讨BAPTA-AM抗AKI的作用.

肾脏是机体重要的排泄器官，机体Cr，BUN等新陈代谢产生的绝大部分代谢终产物经血液进入肾脏，由肾小球滤过或肾小管分泌，随尿液排出体外.AKI时，肾功能发生障碍，表现出Cr和BUN等含量显著增加.本实验中，正常对照组与假手术组肾功能指标(血清Cr，BUN，LDH，Cys C)及氧化应激损伤，组织形态学特征和凋亡情况几乎没有异常，说明本次实验整个开腹分离过程对肾脏并未构成任何损伤.AKI模型组Cr，BUN，Cys C，LDH含量急剧增加，表明发生肾功能障碍，严重的氧化损伤及形态学特征改变，呈现了大量的细胞死亡.与此同时形态学研究发现肾小管扩张，细胞肿胀，髓质充血，呈中度至重度坏死，以上指标证明了模型的成功.BA-L治疗后各指标水平显著降低，表明BA-L能改善AKI大鼠肾功能.肾缺血再灌注损伤时功能障碍致细胞内钙超载，抗自由基能力受损.MDA是自由基引起的脂质过氧化过程中生成的一种醛类物质，其含量在一定程度上反应机体内氧自由基代谢和脂质过氧化损伤程度，是评价氧化损伤的重要指标.SOD可清除体内氧自由基，发挥抗氧化作用从而保护细胞.研究结果表明：BA-L能减少AKI大鼠肾组织MDA含量，提高SOD活性，该作用呈一定的剂量依赖性.肾组织病理学发现，模型大鼠肾小管扩张，细胞肿胀，细胞空泡化，髓质充血，呈中度至重度坏死；BA-L治疗后大鼠肾组织只有轻微改变(肾小球和肾小管上皮细胞轻度水肿)与生化检查结果一致.这些数据证明，BA-L有良好的治疗AKI作用.

4 结 论

研究首次发现50，100，200 μg/kg三个剂量的BA-L治疗大鼠缺血再灌注24 h造成的AKI后，能改善AKI大鼠肾功能，减轻氧化损伤，肾组织损伤明显减轻，证明BA-L有良好的抗AKI之效.且100 μg/kg时BA-L效果最佳，加大剂量药效反而减弱.实验给药时间定为大鼠双侧肾动脉夹闭45 min后，属于治疗用药，所得结果比预防用药更符合临床治疗实际.BA-L有望开发成为临床AKI治疗药物，对于尚无有效药物治疗的AKI患者是一种福音，这为AKI的治疗提供了新线索，新思路.

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