草决明对临床耐药金葡菌的抗菌作用及生物膜形成的影响

吴 铭,刘 根,王京伟,王攀红,韩晶晶,黄红莹

(河南大学 医学院，河南 开封 475004)

研究[1-2]显示：近年来耐药金黄色葡萄球菌( S． aureus)感染是医院感染的重要病原菌之一，尤其在植入性医疗材料表面生长形成生物膜是感染发生的重要原因。此生物膜一旦形成，抗生素、化学消毒剂等均难以渗透, 易产生耐药性，抗感染治疗效果不佳。因此，对临床耐药菌株生物膜形成及其抑制因素的研究已成为抗感染领域的研究热点[3-5]。决明子是医院常用的药用植物，具有清肝明目、润肠通便的功效。现代药理学研究[6]表明，决明子具有抗菌作用， 是国家卫生部公布的药食同源的物质之一。程玲铃等[7]研究显示：决明子提取物中大黄素甲醚对金黄色葡萄球菌等多种细菌均有抑制作用。我们研究首先对金黄色葡萄球菌菌膜培养条件进行了摸索，然后调查了 20 株不同来源分离株的菌膜形成状况并对草决明影响细菌生物膜的作用进行了研究，测定了临床菌株及金葡菌标准菌株最低抑菌浓度及草决明对细菌生长的影响，初步探讨了草决明抑制细菌生长的作用机制。 为实际环境中菌膜的预防和控制及草决明的临床用药提供一定的理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

①菌种: 金黄色葡萄球菌标准菌株25923由河南大学医学院微生物实验室提供，耐药金葡菌临床分离菌株(MRSA菌株)20株由河南大学附属淮河医院微生物检验科提供。②中药: 草决明购于同仁堂大药房。③培养基：普通肉汤、营养琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤培养基等购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 主要仪器

生物安全柜(苏净集团安泰公司)、恒温培养箱(上海福码)、恒温摇床(Thermo forma)、高速台式离心机(eppendorf)、多功能酶标仪(Thermo)。

1.3 实验方法

1.3.1 草决明水提液及醇提液的制备 由药学院中草药实验室提供。

1.3.2 最低抑菌浓度( MIC)测定 取活化的金葡菌，接种于普通肉汤培养基。于200 rpm/min 37 ℃摇床培养7 h，经比浊判定菌量后, 稀释至含菌量为105～106cfu /mL(0.5麦氏度)的菌悬液为目标菌液。于96孔板中，将灭菌后的草决明水提液及醇提溶液用无菌营养肉汤培养基配置成系列浓度稀释液(50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL)，同时用生理盐水做空白对照，然后在无菌操作条件下，接种对数期的金黄色葡萄球菌液 20 μL，摇匀，37 ℃培养 24 h。受试菌株的MIC 测定, 以微量肉汤稀释法培养24 h 后, 肉眼未见细菌生长的药物最低浓度为MIC，经涂板菌落计数<5的为最低杀菌浓度。

1.3.3 金黄色葡萄球菌生长抑制实验 金黄色葡萄球菌培养至对数生长期，用LB 营养肉汤培养基将其稀释成含菌体107个/mL，于37 ℃，200 r/min 培养12 h，每隔2 h 取样测OD 600值，绘制对照组生长曲线; 再取一定量对数期的金黄色葡萄球菌加入到含草决明醇提溶液的LB 培养基中(草决明醇提液浓度为1/2 MIC)，使含菌体107个/mL，继续培养并每隔2 h 取样测OD 600值，制作出草决明醇提液作用后的金黄色葡萄球菌生长曲线。

1.3.4 生物膜形成实验 将TSB肉汤中培养 18 h的金黄色葡萄球菌调至0.5麦氏标准浊度，用TSB肉汤进行1∶100稀释，取菌液加入96孔培养板中，每株4个平行孔，封好四周，37 ℃培养24 h。用微量移液器小心吸干菌液后，用 PBS(pH7.2)缓冲液洗板3次，自然干燥；每孔加入甲醇固定液200 μL，固定20 min。自然晾干，加入5 g/L结晶紫染色20 min，用自来水冲洗，干燥。实验以TSB肉汤作为空白对照，金黄色葡萄球菌ATCC25923作为阴性对照。

1.3.5 生物膜形成抑制实验 选用草决明醇提液的1/2、1/4、1/8 MIC为单独用药浓度。在96孔板中加入草决明醇提液100 μL+菌液100 μL；同时设阴性对照组(不加药物)，37 ℃培养24 h后进行染色，用体积分数为95%的乙醇脱色，酶标仪测定OD值，计算出A570的平均值。 每次测定均重复测3次计算平均值。

1.3.6 草决明-NaCl和草决明-蒸馏水的金葡菌渗透试验 分别配制菌液浓度为106cfu/mL的含不同浓度NaCl和 1/2 MIC浓度草决明醇提液的营养肉汤3 mL,37 ℃摇菌培养12 h,然后在600 nm 下,以不含细菌的营养 肉汤作空白,测定每管吸光度。分别配制细菌悬液为106cfu/mL的不同浓度草决明醇提液的营养肉汤3 mL(1/2、1/4、1/8 MIC 浓度),以不加药物的营养肉汤为阴性对照，37 ℃摇菌培养12 h,蒸馏水处理，于0,4,8,12和24 h时取100 μL菌悬液在琼脂平板上划线培养并计数菌落。

2 结果

2.1 最低抑菌浓度测定

草决明水提液对金葡菌标准菌株和临床菌株的MIC均为50 μg/mL，醇提液对金葡菌标准菌株和临床菌株的MIC 25 μg/mL 、6.25 μg/mL。

2.2 金黄色葡萄球菌生长曲线

当加入1/2 MIC的草决明醇提液时，金葡菌生长的最高OD值降低，与未加药组比较差异不显著，见图1。

2.3 金葡菌生物膜形成实验

不同来源分离株的金葡菌粘附实验结果：12株菌经结晶紫染色后菌膜形成明显，8株有菌膜形成但菌膜较薄，金葡菌标准菌株菌膜形成阴性。

2.4 草决明对耐药金葡菌生物膜形成的影响

草决明醇提液的1/2、1/4 MIC均可明显抑制临床耐药金葡菌生物膜形成，见图2。

图1 金葡菌生长曲线(药物浓度：1/2 MIC)

图2 草决明对耐药金葡菌生物膜形成的影响

2.5 草决明醇提液-NaCl的金葡菌渗透试验

不加草决明醇提液时, 随着NaCl浓度上升, 测试管的吸光度逐渐下降, 当NaC l浓度达到14% 时吸光度接近零, 说明随着NaCl浓度上升, 存活的细菌越来越来少, 当NaCl浓度达到18% 时细菌即不再生长。当1/2 MIC草决明醇提液与不同浓度NaCl共同作用时, NaCl浓度分别达到10%、12% 时吸光度接近零, 说明细菌对NaCl溶液的耐受能力并无明显变化,亦说明药物处理后细菌细胞壁渗透力未明显改变。

2.6 草决明醇提液-蒸馏水的金葡菌渗透试验

蒸馏水处理后，随时间的延长, 不含草决明醇提液的金葡菌悬液菌落计数逐渐减少,12 h后菌落数迅速减少；24 h 后仍有少数菌落存活(耐药菌490 cfu/mL，标准金葡菌267 cfu/mL)。随着加入草决明醇提液浓度的增高, 细菌菌落数逐渐减少,随着时间的变化，12 h后菌落数迅速减少；24 h 后仍有少数菌落存活(1/2 MIC醇提液中耐药菌2.6 cfu/ml，标准金葡菌6.9 cfu/mL)。与未加药菌悬液变化趋势一致，说明草决明醇提液未明显改变金葡菌细胞壁结构，蒸馏水对金葡菌的溶菌能力变化不明显,见表1。

表1 金葡菌蒸馏水渗透实验(菌落计数cfu/L)

3 讨论

耐药金黄色葡萄球菌是细菌生物膜的主要形成菌, 研究显示：细菌形成菌膜后，菌体对外界各种理化因子的耐受能力会大大增强，能够提高细菌对抗菌药物的抗性和抗吞噬作用[8-11]。菌膜状态的金黄色葡萄球菌可引发多方面的问题：与感染反复发作有关，也是造成静脉导管及其他医疗装置相关感染的主要原因，并且由于对抗生素、免疫系统等抵抗能力的增强，增加了对上述疾病的治疗难度[12]； 因此，对于金黄色葡萄球菌菌膜的研究十分重要。

有学者研究[7]证实：草决明的乙醇提取物及氯仿提取物对多种细菌均有抑制作用。 为研究草决明对耐药金葡菌的抗菌作用及菌膜形成的影响，我们从临床患者体内取得耐药金葡菌，首先观察其生物膜形成能力，然后挑选生物膜阳性菌株进行研究，以金葡菌标准菌株为对照，测定了草决明水提液及醇提液的最低抑菌浓度，结果证明醇提液的抗菌作用较强，尤其对耐药金葡菌作用明显。然后通过观察草决明醇提液对耐药金葡菌生物膜形成的影响，证实草决明醇提液具有抑制耐药金葡菌生物膜形成的作用。最后我们通过草决明-NaCl和草决明-蒸馏水的金葡菌渗透试验，探讨了不同浓度草决明醇提液对金葡菌细胞壁的影响，结果证实：随着醇提液浓度的升高，金葡菌细胞壁的渗透能力无明显变化,说明草决明醇提液并未通过对金葡菌细胞壁的渗透作用影响金葡菌生物膜形成，其生物膜抑制作用机制有待进一步研究。

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