高效液相色谱–光电二极管阵列法测定虾青素的含量*

陈伟珠 ，张怡评 ，晋文慧 ，洪专 ，易瑞灶

(1.国家海洋局第三海洋研究所，福建厦门 361005； 2.厦门大学化学化工学院化学系，化学生物学福建省重点实验室，福建厦门 361005)

虾青素 (分子式为 C40H52O4，全称 3，3’-二羟基 -4，4’-二酮基 -β，β’-胡萝卜素 )是一种天然非维生素A 源的类胡萝卜素。虾青素广泛存在于虾、蟹、鱼中，是一种具有超强抗氧化活性的次生类胡萝卜素，比起类胡萝卜素更容易被吸收和积累，是迄今为止人类发现自然界最强的抗氧化剂，其抗氧化活性远远超过现有的抗氧化剂，虾青素的抗氧化能力是维生素E的550倍，茶多酚的200倍，葡萄籽的60倍，β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素和角黄素等类胡萝卜素的10倍，番茄红素的7倍，被称为“超级维生素E”［1-3］。虾青素具有抑制肿瘤、抗氧化、抗癌变、增强免疫功能等多方面的生理作用，可用作抗癌变的预防治疗剂、抗衰老剂、食品着色剂等，是一种具有很大发展前途的生物工程产品，因而在食品添加剂、水产养殖、化妆品、保健品和医药工业方面有着广阔的应用前景［4-5］。

目前，虾青素的检测方法有分光光度法［6-7］、高效液相紫外法［8-10］、高效液相色谱 - 质谱法［4-11］。高效液相色谱紫外法由于操作简单成为目前虾青素常规的检测方法。笔者在参考文献的基础上建立了高效液相色谱紫外法检测虾青素的方法，该方法灵敏度高、测定结果准确。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：2695型，配有光电二级管阵列检测器(PDA)，美国Waters公司；

分析天平：CPA2P型，德国Sartorius公司；

超纯水机：Mili-Q型，德国Millipore公司；

虾青素标准品：纯度不小于99%，百灵威公司；

2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)：试剂纯，国药集团化学试剂有限公司；

虾青素标准储备液：40 μg/mL，精密称取2 mg虾青素标准品，溶于BHT乙腈溶液，定容至50 mL，充氮气置-18℃冰箱保存；

BHT乙腈溶液：10 mg/mL，2.5 g BHT溶解于250 mL乙腈；

甲醇、乙腈：色谱纯，德国Merck公司；

盐酸、氢氧化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

30%双氧水：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 HPLC色谱条件

色谱柱：Purospher STAR RP 18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温为30℃；流动相：甲醇-水(体积比为95∶5)，流速为1.0 mL/min；检测波长：482 nm；进样量20 μL。

2 结果与讨论

2.1 分离条件的选择

固定流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，比较甲醇-水体系和乙腈-水体系作流动相对虾青素进行分离的效果。结果表明，甲醇-水体系的分离效果稍优于乙腈-水体系，所以选择甲醇-水体系作为流动相体系。考察甲醇-水的不同配比对分离效果的影响，最终选择甲醇-水(体积比为95∶5)作为流动相。色谱图如1所示。

2.2 专属性考察

量取适量体积的虾青素储备液，配制成质量浓度为 4 μg/mL 的溶液，分别加入 HCl(1 mol/L)，NaOH(1 mol/L)，30% H2O2，高温加热进行强酸、强碱、氧化及加热破坏试验，结果显示各降解产物均可与虾青素良好分离，色谱图如图2所示。

图2 在强酸、强碱、氧化及加热破坏试验下的虾青素谱图对照

2.3 标准曲线及检出限、定量限

分别精密量取不同体积的虾青素储备液稀释至刻度并摇匀，得到质量浓度为 0.2，0.4，1，2，4，8，16 μg/mL的系列标准工作溶液，按1.2色谱条件进行分析，结果见表1。以色谱峰面积(Y)对溶液质量浓度(X，μg/mL)进行线性回归，得回归方程为Y=147780X-3453.8，线性相关系数r=0.999 9。结果表明，虾青素在0.2～16 μg/mL范围内呈现良好的线性。以S/N=3计算得检出限为0.01 μg/mL，以S/N=10计算得定量限为0.05 μg/mL。

表1 虾青素标准工作溶液测定结果

2.4 回收试验

取虾青素标准品适量，精密称定，分别用BHT乙腈溶液溶解并定容配制成不同质量浓度水平的溶液各3份，作为供试溶液进行回收试验，结果见表2。由表2可知，平均回收率为96.6%～105.2%，相对标准偏差为2.52%，表明本法测定结果准确可靠。

表2 回收试验结果

2.5 精密度试验

取一定体积虾青素储备液，加BHT乙腈溶液配制成4 μg/mL虾青素溶液，作为供试溶液。精密吸取20 μL进样，连续进样6次，结果见表3。结果表明，本法精密度良好。

表3 精密度试验结果

2.6 稳定性试验

取4 μg/mL虾青素供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h进行测定，记录峰面积，结果见表 4。由表4可知，供试品溶液在24 h内相对稳定。

表4 稳定性试验结果

3 结语

建立了高效液相色谱测定虾青素含量的方法，该方法的检出限低于文献报道方法的检出限且线性范围宽，回收率好，灵敏度高，精密度好，可满足虾青素相关产品的检测分析。

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