柱前衍生–高效液相色谱法测定白刺果中氨基酸含量*

杜平 ，王新风 ，冯辉 ，马巍 ，富建

(1.吉林省伊通县科学技术协会，吉林伊通 130700； 2.吉林省农业科学院，长春 130033； 3.长春市产品质量监督检验院，长春 130012)

白刺(nitraria)是蒺藜科(zygophyllceae)的旱生或超旱生典型沙漠植物，其抗逆性强，耐干旱盐碱，是防风固沙的优良灌木［1-2］。白刺在全世界共有12个品种，我国有8种，主要分布在青海、新疆、甘肃、宁夏和内蒙古等地［3］。白刺果实具有健胃补脾、滋阴润肺、解表安神等功效［4］，是蒙、藏和维吾尔等少数民族的传统药材，广泛用于多种疾病的治疗，同时具有广谱的营养作用［5］。

笔者对邻苯二甲醛(OPA)和氯甲酸芴甲酯(FMOC)联合柱前在线衍生、反相高效液相色谱(RP-HPLC)内标法快速测定白刺果中氨基酸含量进行了研究。与传统的氨基酸分析方法相比［6-11］，本方法具有样品处理简单、自动化程度高、分析时间短、灵敏度和准确度高等优点，适合白刺果中氨基酸含量的测定。利用本方法对产自青海、新疆和内蒙古3个地区的白刺果中氨基酸含量进行测定，并对氨基酸含量及组成进行分析比较，为其进一步研究和开发利用提供参考数据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1100型，包括G1322A真空脱气机、G1312A双元泵、G1329A自动进样器、G1330A自动进样器控温装置、G1316A柱温箱、G1315B二极管阵列检测器(DAD)和G1321A荧光检测器(FLD)，美国Agilent公司；

实验室高速粉碎机：A11型，德国IKA公司；

电热恒温干燥箱：最高温度350℃，控温精度±1℃，日本Yamato公司；

真空泵：DOA-V130-BN型，美国Waters公司；

台式离心机：EBA21型，德国Hettich公司；

超声波清洗器：KQ-2500B型，中国昆山超声波仪器有限公司；

实验室快速混匀器：Inchi HM-10型，日本Jircas公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，美国Fisher公司；

NaH2PO4·H2O：分析纯，美国 Sigma-Aldrich公司；

硼酸缓冲液：0.4 mol/L，pH 10.2，美国 Agilent公司；

邻苯二甲醛(OPA)、氯甲酸芴甲酯(FMOC)：1 mL，美国Agilent公司；

OPA溶液：将10 mg OPA溶于1 mL 0.4 mol/L硼酸缓冲液中，摇匀；

FMOC溶液：2.5 mg FMOC 溶于1 mL乙腈中；

丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸标准混合液：浓度均为 1 mmol/L，介质为 0.1 mol/L 的盐酸溶液，美国Agilent公司；

内标戊氨酸：纯度不小于99%，美国Sigma-Aldrich公司；

巯基乙醇：分析纯，北京化学试剂厂；

实验用水为超纯水；

白刺果样品：风干样品，中国农业科学院特产研究所。

1.2 溶液配制

内标溶液配制：准确称取适量戊氨酸，用0.1 mol/L HCl配制成浓度为50 mmol/L的内标储存液，临用时稀释。

氨基酸混合标准液配制：将浓度为1 mmol/L的氨基酸混合标准储备液稀释至不同浓度，再与适当浓度的戊氨酸内标溶液按一定比例混合，配制成浓度分别为 4.5，45，225，450，900 μmol/L 的 17 种氨基酸(内标戊氨酸浓度均为250 μmol/L)混合标准溶液。

1.3 样品处理

将风干样品置于(65±1)℃烘箱中烘干24 h左右，至恒重。将烘干后的样品粉碎(粒径约250 μm)后，置于棕色广口瓶中备用。样品水解采用酸水解方法，具体步骤如下：准确称取30 mg粉碎后样品于具螺旋盖的水解管中，加入10 mL 6 mol/L的HCl、125 μL 50 mmol/L 的内标溶液和 100 μL 巯基乙醇，混匀。向水解管中冲氮气2 min，完全置换出其中的空气，封盖。将密封好的水解管放入烘箱内，于(110±1)℃水解22～24 h。取出冷却至室温，过滤至25 mL容量瓶内，用5 mol/L NaOH溶液调至pH 1左右，加水定容。取定容后的水解液1 mL于离心管内，在14 000 r/min下离心15 min，吸取0.5 mL左右上清液于HPLC样品瓶中，待测。

1.4 色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse AAA C18柱(75 mm×4.6 mm，3.5 μm，美国Agilent公司)；流动相：A为40 mmol/L NaH2PO4溶液，pH 7.8；B为乙腈-甲醇-水(体积比为4.5∶4.5∶1)；流动相梯度洗脱程序：0.0～1.0 min(B ：0%)，1.0～9.8 min(B ：0%～57%)，9.8～10.0 min(B ：57%～100%)，10.0～12.0 min (B ：100%)，12.0～12.5 min(B ：100%～0%)，12.5～14.0 min(B：0%)；流速：2 mL/min；柱温：40℃；DAD检测波长：0.0～8.5 min时，紫外波长为338 nm(谱带宽为10 nm)，参考波长为390 nm(谱带宽为20 nm)；FLD检测波长：0.0～8.5 min(激发波长为340 nm，发射波长为450 nm)，8.5～14.0 min(激发波长为266 nm，发射波长为305 nm)；自动衍生程序：分别吸取2.5 μL硼酸缓冲液和0.5 μL标准溶液或样品水解液，充分混合，静置30 s，洗针，吸取0.5 μL OPA溶液充分混合，洗针，吸取0.5 μL FMOC溶液充分混合，吸取32 μL水，充分混合；进样体积：18 μL。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的选择

蛋白质在酸水解过程中影响氨基酸测定准确度的干扰物质较多(如碳水化合物、脂肪等)，通常是在水解前将其除去。但是这样不但使操作繁琐，同时也会引入误差。笔者将水解方法进行了改进，即在水解前加入已知浓度的内标物戊氨酸来校正蛋白质在水解过程中的物理和化学损失，同时简化了操作步骤。选择戊氨酸的原因是首先它不存在于天然蛋白质中，并且与组成蛋白质的氨基酸化学性质相近，其次在色谱分离过程中又能与其它氨基酸很好地分离。色谱图见图1。

图1 氨基酸标准溶液(a，b)与样品溶液(c，d)色谱图

水解液的处理采用加碱中和法，省去了旋转蒸发赶酸和浓缩等繁琐的操作步骤，同时也减少了误差来源，使测定结果更加准确。

2.2 色谱条件的选择

OPA和FMOC都是常用的氨基酸衍生试剂，将两者联合使用，提高了衍生效率。衍生过程利用自动进样器按1.4的自动衍生程序来完成，可以提高自动化程度和重现性。但应该注意的是OPA在空气中不稳定，易氧化降解而失效，建议每3 d更换一次，若长期不用应注意隔绝空气并且低温冷冻保存。而FMOC具有挥发性且有微弱毒性，使用时需谨慎操作。

本研究使用DAD和FLD联合检测氨基酸的衍生物，可同时测定16种氨基酸含量。使用FLD检测(图1 b、图1 d)时杂质干扰小，基线平稳，检测灵敏度比DAD高10倍以上，但是赖氨酸在荧光检测器上响应值较小，需要使用DAD检测器检测(图1 a、图 1 c)。

HPLC法测定氨基酸的分析时间一般需要30 min，而采用经典的氨基酸分析仪法分析时间需1 h左右。实验采用反相C18短柱(75 mm)和高压二元梯度大流量洗脱测定氨基酸，将1次进样分析时间缩短至14 min，大大提高了分析效率。

2.3 线性方程与检出限

将1.2中配制的氨基酸混合标准液，按1.4的色谱条件依次进行测定，以各氨基酸峰面积(Y)为纵坐标，氨基酸浓度(X，μmol/L)为横坐标进行线性回归得到回归方程，各氨基酸浓度在4.5～900 μmol/L范围内具有良好的线性关系，相关系数r在0.991 2～0.999 8之间。以信噪比S/N=3计算检出限(LOD)，结果见表1。由于赖氨酸是使用DAD检测器，所以比其它氨基酸的检测灵敏度低。

表1 线性方程、线性范围与检出限

2.4 回收试验与精密度试验

准确称取已知氨基酸含量的同一样品5份，按与氨基酸含量相当的浓度加入氨基酸标准液，测定其回收率，计算相对标准偏差(RSD)，结果见表2。结果表明，各氨基酸的回收率，除蛋氨酸为78.1%(部分被氧化破坏)外，其它在93.1%～105.1%范围内，RSD为3.21%～6.23%。说明该方法准确度和精密度较高。

表2 回收试验与精密度试验结果(n=5)

2.5 实际样品测定

对分别产自青海、新疆和内蒙古等3个地区的白刺果中的氨基酸含量进行测定，结果见表3。3个地区白刺果中氨基酸总量分别为11.23，10.47，8.84 g/(100 g)，其中内蒙古地区白刺果氨基酸含量最低，青海地区含量最高；3个地区白刺果中必需氨基酸和半必需氨基酸(组氨酸、苏氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸)之和分别占总量的53.61%，56.26%和53.39%；芳香族氨基酸(酪氨酸和苯丙氨酸)分别占总量的12.20%，10.60%和12.90%；增香族氨基酸(精氨酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸)分别占总量的48.44%、46.99%和43.55%；输液氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和赖氨酸)分别占总量的66.52%，57.50%和61.20%；酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)分别占总量的20.57%，19.20%和20.48%；碱性氨基酸(组氨酸、精氨酸和赖氨酸)分别占总量的18.61%，18.43%和16.86%；中性氨基酸(丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸)分别占总量的60.82%，62.37%和62.67%；结果表明：虽然氨基酸总量因白刺果的产地不同而存在一定差异，但是各种不同类型氨基酸所占氨基酸总量的比例差别不大。

表3 不同产地干基白刺果氨基酸含量测定结果 g/(100 g)

3 结论

采用OPA和FMOC联合柱前在线自动衍生，反相C18色谱柱分离、二元梯度洗脱、DAD和FLD联合检测的高效液相色谱法测定白刺果中氨基酸含量。结果表明：本方法与传统氨基酸分析方法相比，具有样品前处理简单(无需预先去除干扰物质以及对水解液进行蒸发赶酸)，灵敏度、准确度高，分析时间短(仅14 min)等优点。用该法对产自青海、新疆和内蒙古3个不同产地白刺果氨基酸含量进行了测定，发现不同产地白刺果氨基酸总量存在一定差异，但是各种不同类型氨基酸占总量的比例相当。

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