动态负荷力对软骨前体干细胞甲状旁腺激素相关肽的影响及细胞外基质蛋白组研究

靳松 彭建强 林昆 黄爱军 李亚杰

力学刺激对软骨细胞的功能活动及骨的正常发育与成熟具有重要影响，而甲状旁腺激素相关肽(PTHrP) 在骺板软骨分化发育中起关键作用，在钙磷代谢、骨矿化等方面发挥生物学作用[1]。骺板软骨前体干细胞(PSC)是骺板周围软骨膜及静止区中存在的一类可以分裂增殖、自我更新的成体干细胞[2]。本研究采用动态压力细胞培养装置对体外培养的骺板软骨PSC予不同强度和持续时间的压力刺激，探讨其对PTHrP mRNA表达水平的影响及相互联系，并借助于蛋白质组学技术，寻找和发现动态压力作用下调控软骨细胞代谢和功能改变的特定的蛋白质分子，为动态压力作用下软骨改建机制的更深入研究提供依据。

材料与方法

一、实验动物

健康新生24 h SD大鼠，SPF清洁级，雌雄不限，体质量(5.2±0.5)g，购自广东省医学实验动物中心，动物合格证编号为粤检证字2002A015号。

二、主要试剂及仪器

胎牛血清(Gibco公司，美国)，胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、琼脂糖(Sigma公司，美国)，DMEM/F12培养基(Hyclone公司，美国)，兔多克隆成纤维细胞生长因子受体-3(FGFR-3)抗体(SantaCruz公司，美国)，Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)，逆转录试剂盒(Toyobo公司，日本)， PCR试剂盒(广州东盛生物科技有限公司)；miniMACS磁性细胞分选系统及相关试剂(Miltenyi公司，德国)，细胞培养箱(Forma公司，美国)，倒置相差显微镜(Nikon公司，日本)，荧光显微镜(OLYMPUS公司，日本)，PCR仪(Eppendorf公司，德国)，凝胶成像分析系统(Bio-RAD公司，美国)，可控动态细胞压力加载装置(由中山大学骨科研究所提供)。

三、实验方法

1.骺板软骨PSC的分离纯化及培养鉴定

根据文献[3]的方法，以显微手术器械剪取股骨下端骺板两端的软骨膜组织充分剪碎，用2.5 g/L胰蛋白酶消化5 min后离心2 min，弃上清后用1.0 g/L Ⅱ型胶原酶37℃消化2 h，200目滤网过滤，离心8 min后收集细胞，调整密度后接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养。采用miniMACS磁性细胞分选系统分离纯化PSC，原代细胞消化后通过单细胞滤器悬浮于Buffer溶液中，加入多克隆抗体FGFR-3，孵育15 min，离心洗涤后加入免疫磁珠室温孵育15 min，洗涤后通过磁场，按使用说明获得纯化后的FGFR-3阳性细胞。收集第3代PSC，用免疫荧光试剂盒检测细胞FGFR-3的表达情况。

2.实验分组及处理

将体外培养的第3代PSC分为30、60、90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)组和对照组，各组再分2、6、24 h 3个时间点亚组，总计12组，每组3个样本。采用开放式压力控制培养系统，通过压力表观察具体压力数值并记录加压时间。

3.半定量PCR

用Trizol一步法提取各组细胞总RNA(具体操作按说明书步骤进行)，分光光度计检测浓度及纯度，取1 μg总RNA按逆转录试剂盒一步法得到模板DNA。然后取各组模板DNA 1 μl分别加入上、下游引物(10 μmol)各1 μl、2倍体积PCR Taq混和物12.5 μl (含100 mmol KCl，20 mmol Tris-HCl，3 mmol MgCl2，500 μmol dNTP 混和物，0.1 U/μl Taq DNA聚合酶等)，补足超纯水至25 μl。PCR扩增：95℃预变性3 min，于94℃变性20 s，退火20 s，72℃延伸15 s，退火温度60℃及循环32次。PTHrP基因的引物序列，正向5’-GACTTGCCCTTGTCATGCAGT-3’，反向5’-GGAGCGTCCTGGTGTTCCT-3’。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参。制备2%琼脂糖凝胶，对各组PCR产物进行电泳，结束后用凝胶成像系统分析软件照相，并对各电泳条带吸光灰度度值进行分析。

4.双向电泳图像分析和差异斑点的质谱鉴定

参考文献[4]的方法，设置参数，处理分离样品蛋白组织。使用欧洲分子生物学实验室(EMBL)法行银染色。扫描图像后采用ImageMaster 2-D Elite Software 5.0图像分析软件对凝胶进行分析，以蛋白点体积为指标，点体积图像小于1.0×e5及大于1.0×e8(蛋白质点过小及过大) 的蛋白质点不纳入差异分析，用DeCyder V6.0 分析软件行DeCye胶内差异分析，寻找差异表达蛋白点，蛋白点平均体积差异大于2倍(表达差异上调2倍或下调2倍)。使用全自动凝胶斑点处理工作站从凝胶中切出斑点，干燥、胰蛋白酶解与基质混合后，使用基质辅助激光解吸/离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪进行肽质量指纹图谱鉴定(PMF)。使用胰蛋白酶自切峰(842.509，2 211.104)作内标矫正，使用Frofound软件在美国国家生物技术信息中心非冗余(nr)数据库检索结果。

四、统计学处理

结 果

一、原代细胞和传代细胞的倒置显微镜观察

采用免疫磁珠分选系统刚分离的PSC呈圆形，折光性好，12 h后开始沉降贴壁，逐渐伸展为多边形，胞质丰富，细胞呈单层生长(图1A)。细胞传至第3代后的细胞状态较好，增殖速度较快，细胞FGFR-3免疫荧光染色仍呈阳性表达(图1B)；随着传代次数增加，细胞逐渐以梭形为主，折光性降低，细胞增殖速度明显减慢。

图1 PSC的显微镜下形态学观察(×200)

二、不同强度和刺激时间对PSC PTHrP mRNA表达水平的影响

电泳图像显示，各组细胞均有不同程度的PTHrP mRNA表达，见图2A。各时间点不同压力强度组间比较差异有统计学意义(F=9.597，P<0.05)，压力值越大，相同时间点mRNA相对表达量越高。细胞给予动态压力刺激2 h后，各实验组PTHrP mRNA的表达水平均高于对照组 (P均<0.01)；随着刺激时间的延长，PTHrP mRNA的表达水平也逐渐升高。刺激24 h后各实验组PTHrP mRNA的表达水平明显高于对照组(P均<0.01)，见图2B。

图2 动态压应力作用下不同强度和时间点PTHrP mRNA表达情况

三、不同强度和刺激时间对PSC细胞外基质蛋白质组表达水平的影响

在对照组和实验组间呈差异表达共有6种蛋白质，分别为：脯氨酰羟化酶α亚单位(PHα)、丙酮酸激酶(PK)、L-乳酸脱氢酶(LDH)、脯氨酰羟化酶β亚单位(PHβ)、细胞骨架蛋白destrin和烯醇酶(enolase)，见图3及图4。两组间6种蛋白定量比较差异均有统计学意义(P均<0.05)，见图5。

图3 实验组(A)和对照组(B)双向电泳图谱

图4 实验组和对照组双向电泳图谱差异斑点放大图

图5 6种差异蛋白在正常对照组和实验组的表达比较

讨 论

力学刺激作为细胞外信号，通过信号转导可引起骺板细胞内生物活性物质的一系列变化，进而影响细胞功能代谢，但是软骨细胞对不同性质的力学刺激有不同反应的机制以及体内激素、相关细胞因子的变化和联系尚不明确。有报道，软骨细胞的增殖分化在压力下改变较为明显，这可能与细胞PTHrP的表达改变有关[5]。PTHrP在各种种属发育和成熟的组织中广泛表达，主要通过旁分泌和自分泌途径进行调节，在钙磷代谢、骨矿化和细胞生长分化、细胞外基质分泌等许多方面发挥重要生物学作用。本研究显示，PSC在动态压力培养环境下，各时间点PTHrP表达水平均明显高于对照组；PTHrP mRNA的表达水平随时间增加而升高；同一时间点，压力越大， PTHrP mRNA表达水平越高。结果提示适当的负荷力刺激能上调PTHrP表达水平，PTHrP在力学信号转导过程中可能起重要作用。

本研究进一步借助蛋白质组学技术，寻找和发现动态压力作用下调控软骨细胞代谢和功能改变的特定的蛋白质分子。结果发现了6种在对照组与实验组间呈差异表达的蛋白质，分别为代谢相关酶(如烯醇酶、PK、LDH、PHα、PHβ)和细胞骨架蛋白destrin。

脯氨酰羟化酶(PH)属于二硫化物异构酶，可引起蛋白外表结构发生改变，在人类主要存在α、β、γ3个亚型，其中PHα和PHβ在软骨细胞Ⅱ型胶原的合成中起重要作用[6]。PHα和PHβ在正常和骨关节炎软骨中均有表达，骨关节炎患者的PHβ表达水平可有升高。PK广泛存在于人体各组织细胞浆内，是糖酵解途径3个关键调节酶之一。PK催化磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸，影响糖酵解的速度。有报道，正常细胞PK活性处于低水平，当局部缺血、缺氧，PK活性明显增高[7]。LDH是一种普遍存在的细胞溶质酶，主要催化糖酵解。既往研究显示，健康软骨中的LDH水平从表面到深层逐渐下降，而在病变软骨中缺乏LDH表达[8]。Actin细胞骨架结构被认为是软骨细胞表型的重要调节者，其主要作用是维持细胞的机械完整性。Destrin属于肌动蛋白Actin黏附蛋白ADF家族，其基因编码了Actin的脱聚合物Cofilin，可提高体内Actin的转化率[9]。烯醇酶是参与糖酵解的一组酶，其催化2-磷酸甘油酸向烯醇式丙酮酸的转化，在ATP的合成代谢过程中起重要作用[10]。烯醇酶除了在糖酵解过程中发挥作用，还是缺氧诱导因子的靶基因，在调节细胞凋亡和增殖上起关键的作用。业已证实，在低氧环境和前炎症因子刺激下烯醇酶水平升高，而这两个都是软骨破坏的重要因素[11]。本研究显示，在给予PSC 90 mm Hg持续24 h的动态压力后，发生改变的蛋白多数是能量代谢蛋白，而且实验组的6种蛋白质表达水平均高于对照组，可能是压力刺激作用于PSC，促进了软骨基质的生物合成和转化，促使软骨改建。但实验所得阳性意义的信息毕竟是有限的，除去实验方法本身客观存在的局限性之外，实验操作太过繁琐，实验周期漫长，且实验消耗也是相当昂贵的。虽然得到了6个阳性结果，但调控其表达的上下游关系还不清楚，其所代表的压力作用下调控关节软骨细胞的信号分子通路也不得而知，同时，候选蛋白也只是代表了翻译水平的差异，对其功能认识还需要进一步探讨研究。

总之，本研究通过差异蛋白质组学研究发现了动态压力作用下调控终板软骨细胞生物学行为的6个有意义的关键蛋白质，并推测了其在软骨改建中的作用。为今后研究这些差异蛋白在骺板软骨细胞受压力刺激后代谢和功能变化的生物学作用提供了实验依据。

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