参蛇软膏的质量标准研究

石小鹏，缪 珊，李 捷，毕琳琳，苗 青，栗 艳*(.第四军医大学西京医院药剂科，西安 7003；.第四军医大学药学系天然药物学教研室，西安 7003)

参蛇软膏剂型为软膏剂，由苦参、蛇床子、地肤子、土茯苓等中药组成。作为外用制剂，临床主要用于蚊虫叮咬、皮肤瘙痒等。为了有效地控制制剂质量，笔者对处方中的苦参、黄柏、蛇床子、土茯苓进行定性鉴别[1-5]，采用HPLC法测定蛇床子中的有效成分蛇床子素的含量[6-8]，为该制剂的质量控制和评价指标提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津)；薄层色谱成像系统(瑞士CANAG公司)；R200D电子分析天平(德国Sartorius公司)；HH-S4型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；SB5200型超声波仪(上海必能信超声仪器有限公司)。

1.2试药 蛇床子、黄柏对照药材，苦参碱对照品(批号110805-200507)、蛇床子素对照品(批号110822-200406)、盐酸小檗碱对照品(批号110713-200910)、落新妇苷对照品(批号111798-200901)，以上均由中国药品生物制品检定所提供；硅胶G板(青岛海洋化工厂)；参蛇软膏(第四军医大学药物研究所提供，批号130301，130302，130303)；甲醇、乙腈为色谱纯试剂，水为超纯水，其他均为分析纯试剂。

2 定性鉴别

2.1苦参的薄层色谱鉴别 称取本品3 g，置于圆底烧瓶中，加水30 mL，水浴上加热回流30 min，取出，放冷，滤过，滤液用浓氨水调节pH至11，用氯仿萃取3次(30，15和15 mL)，合并氯仿萃取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使其溶解，作为供试品溶液。取苦参阴性对照(按处方及制备工艺制备成不含苦参的阴性对照样品)2 g，按上述制备方法制成苦参阴性对照溶液。另取苦参碱对照品，加甲醇制成1 mg·mL-1的对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验，吸取上述3种溶液各8 μL，分别点于同一以5 g·L-1羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，展开剂为苯-丙酮-乙酸乙酯-浓氨水(10∶15∶20∶1)，展开，取出，晾干，再喷以稀碘化铋钾试液，置于日光下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。

2.2蛇床子的薄层色谱鉴别 称取本品2 g，置于圆底烧瓶中，加入甲醇20 mL，水浴上加热回流30 min，取出，放冷，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液。取蛇床子阴性对照样品(按处方及工艺制备成不含蛇床子的阴性对照样品)2 g，按上述制备方法制成蛇床子阴性对照溶液。另取蛇床子对照药材0.3 g，同法制成对照药材溶液。再取蛇床子素对照品，加甲醇制成1 mg·mL-1的对照品溶液。照薄层色谱法进行实验，吸取上述4 种溶液各8 μL，分别点于同一以5 g·L-1羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，展开剂为甲苯-乙酸乙酯-正己烷(3∶3∶2)，展开，取出，晾干，于365 nm紫外光灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。

2.3黄柏的薄层色谱鉴别 称取本品2 g，加入甲醇20 mL，超声处理30 min，取出，放冷，滤过，取滤液作为供试品溶液。取黄柏阴性对照(按处方及工艺制备成不含黄柏的阴性对照样品)2 g，按上述制备方法制成黄柏阴性对照溶液。另取黄柏对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成1 mg·mL-1的对照品溶液。照薄层色谱法进行实验，吸取上述4种溶液各10 μL，分别点于同一以5 g·L-1羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，展开剂为正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)，展开后，取出，晾干，置于365 nm紫外光灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。

2.4土茯苓的薄层色谱鉴别 称取本品5 g，置于具塞锥形瓶中，加水30 mL，于水浴上加热回流1 h，取出，放冷，滤过，滤液用乙醚提取3次。每次15 mL，弃去乙醚液，用氯仿提取3次，每次15 mL，弃去氯仿液，再用乙酸乙酯提取3 次(30，15和15 mL)，合并提取液，浓缩至1 mL，作为供试品溶液。再取土茯苓阴性对照(按处方及工艺制备成不含土茯苓的阴性对照样品)2 g，按上述制备方法制成土茯苓阴性对照溶液。另取落新妇苷对照品，加甲醇制成1 mg·mL-1的对照品溶液。照薄层色谱法进行实验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一以5 g·L-1羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸(13∶32∶19)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以20 g·L-1三氯化铝乙醇溶液，于365 nm紫外光灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。

3 含量测定

3.1色谱条件 Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-水(65∶35)为流动相；检测波长：320 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL；理论板数按蛇床子素计不低于3 000。

3.2对照品溶液的配制 精密称取4.40 mg蛇床子素对照品，置于50 mL量瓶中，加乙醇溶解，稀释并定容至刻度，摇匀，得质量浓度88.0 mg·L-1的溶液，作为对照品溶液。

3.3供试品溶液的制备 精密称取本品5 g，置于圆底烧瓶中，精密加入50 mL甲醇，密塞，精密称定质量，水浴加热回流40 min，取出，放至室温，再精密称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

3.4阴性对照溶液的制备 按处方比例称取处方药材，再按制备工艺制成缺蛇床子的阴性样品，精密称取阴性样品5 g，按2.3项下的制备方法制成阴性对照溶液。

3.5专属性实验 精密吸取上述溶液，按2.1项下的色谱条件进行测定，结果供试品溶液在与对照品溶液相对应的位置上有相同的色谱峰，而阴性对照则无色谱峰出现，说明样品中其他成分对蛇床子素无干扰，其专属性强，色谱图见图1。

3.6标准曲线制备和线性范围考察 精密量取对照品溶液1，2，3，4和5 mL，置于不同的5 mL量瓶中，加乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，依次得到质量浓度为17.6，35.2，52.8，70.4和88.0 mg·L-1的对照品溶液，按2.1项下的色谱条件进行测定，记录峰面积，以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制线性回归方程：Y=69 485X+38 475(r=0.999 9)，结果蛇床子素在17.6～88.0 mg·L-1范围内呈良好的线性关系。

图1 HPLC图

3.7精密度实验 精密吸取质量浓度为35.2 mg·L-1的对照品溶液和同一批号(130301)的供试品溶液各20 μL，按2.1项下的色谱条件进行测定，结果对照品RSD为0.15%(n=5)，样品RSD为0.23%(n=5)，结果表明，其精密度良好。

3.8稳定性实验 精密吸取质量浓度为52.8mg·L-1的对照品溶液和同一批号(130302)的供试品溶液各20 μL，按2.1项下的色谱条件分别间隔0，1，2，4和8 h进行测定，结果对照品RSD为0.51%(n=5)，样品RSD为0.23%(n=5)，结果表明，蛇床子素在15 h内稳定。

3.9重复性实验 精密称取同一批号(130303)样品5份，按2.3项下的制备方法制成供试品溶液，按上述色谱条件进行检测，蛇床子素的平均含量为0.297 mg·g-1，RSD=0.61%(n=5)。

3.10加样回收率实验 精密称取已知含量的样品6份，分别加入蛇床子素对照品1.0，1.0，1.5，1.5，2.0和2.0 mg，按2.3项下的制备方法制成供试品溶液，再按2.1项下的色谱条件进行测定，测得平均加样回收率为99.6%，RSD为0.4%，测定结果如表1所示。

表1 蛇床子素加样回收率测定结果

3.11样品含量测定 精密称取3批参蛇软膏样品各5 g，按2.3项下的制备方法制成供试品溶液，再按2.1项下的色谱条件进行测定，结果如表2所示。

表2 参蛇软膏中蛇床子素的含量测定结果

4 讨论

在薄层色谱中，曾对苦参、蛇床子、黄柏和土茯苓的供试品制备及展开系统的方法优选，经过多次实验研究，最终优选的制样方法过程简单，分离度好，不受其他成分干扰，专属性强，重复性好，结果可靠，可作为参蛇软膏的定性指标。

蛇床子为处方君药，主要含有香豆素类成分，蛇床子素为主要活性成分之一，近代药理研究证实，蛇床子素对抑制乳腺癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡有明显作用，另外还有降血脂、抑制血栓形成及抗菌止痒等作用[9-10]。因此，将其作为含量测定指标之一，能直接影响到药品的疗效。通过文献查询及预实验，我们采用了适用于本品的HPLC法对蛇床子素的含量进行了研究[6-8]。曾选择不同色谱条件进行实验，结果表明，流动相为乙腈-水(65∶35)、流速为1.0 mL时，蛇床子素与其他组分得到较好地分离，且峰形对称，能准确测得其含量。在实验中，采用甲醇、乙醇2种不同的溶剂以及不同的溶剂量，选择超声波提取和回流提取的方法制备供试品溶液。结果表明，甲醇50 mL回流提取的含量明显较高，故选择甲醇回流提取；对回流提取时间的考察：分别选择提取15，30，40和60 min，结果提取30 min时所测得蛇床子素的含量明显高于15 min，提取40 min时所测得蛇床子素的含量则高于30 min时的含量，而提取40 min与提取60 min时的含量没有明显差别，故选择40 min为最佳提取时间。经过方法学研究，该方法样品处理简单，测得的结果回收率高，精密度好，可以有效控制制剂的质量。

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